多重逆转录聚合酶链反应检测流感病毒

目的：建立特异敏感的热速检测流感病毒的分子生物学方法。方法：用多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应扩增甲1、甲3和乙型流感病毒的HA基因的HA1片段。根据扩增产物的大小检测流感病毒。结果：以流感病毒的HA基因为模板设计的三对引物能特异性地扩增出942bp、1117bp和751bp的核酸片段，它们分别和甲1、甲3和乙型流感病毒有稳定对应关系。根据扩增产物的大小可以检测流感病毒。用这个方法能检测病毒浓度为0．1TCID50的样品。还可以直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。结论：多重逆转录聚合酶链反应连接多重聚合酶链反应是检测流感病毒的特异敏感的方法，此法还能直接从疑似流感病人的含漱液中检测到乙型流感病毒。     

浙江省2008-2012年肠道病毒相关病毒性脑炎病原谱及分子流行病学特征分析

目的 了解2008--2012年浙汀省肠道病毒相关病毒性脑炎病原谱及分子流行病学特征。方法从监测点采集疑似病毒性脑炎患者脑脊液和粪便样本利用RD和HeP-2细胞分离病毒,采用肠道病毒标准血清定型,并对分离株VPI基因测序,进行同源性与进化分析。结果从610例患者616份样本中分离到人类肠道病毒(HEY)127株(20.6%),其中柯萨奇病毒(CV)60株,埃可病毒(ECHO：E)67株,病毒血清型分别为CVA9、CVBl、CVB3～5、E3、E4、E6、E9、E14、E25、E30。2008～2012年优势株分别为CVB3、CVB5、E6、E30和E30。各分离株VPl基因序列全长834～918个核苷酸,与相应原型株核苷酸(nt)和氨基酸(aa)的同源性分别为76.7%～85.0%和91.1%。97.9%；浙江分离株型内差异最大为E6,nt和aa差异分别为20.4%和4.8%。基于VPl基因的进化分析结果表明。浙江分离株均位于HEV-B分支上,并显示出一定地域和时问效应；E6血清型内部又分成2小分支。结论2008-2012年浙江省病毒性脑炎的主要病原为HEV-B,涉及12个血清型；不同年份优势流行株不断变化,E30为绝对优势株；浙江E6分离株存在2个亚类流行株。     

浙江省1 998年H3N2流感流行的溯源研究

目的 对1998年浙江省的H3N2流感流行进行溯源研究.方法 采用RT-PCR扩增浙江省1998年3株H3N2流感流行代表株的全基因组序列,并与GenBank上1995-1998年世界其他地区H3N2流感流行株进行比较;同时,采用交叉血凝抑制实验,计算各毒株间的抗原比.结果 HA基因进化树表明,1998年浙江省H3N2优势流行株A/Zhejiang/11/98、A/Zhejiang/18/98与1995-1996年世界各地以及1997年我国大陆的H3N2流行株间存在显著差异,在进化树上虽与A/Sydney/5/97同属一簇,但和美国纽约以及中国香港1997年后期流行株更为接近.在HA1、NA和MP基因上,A/Zhejiang/18/98与香港1997年后期流行株同源性最高,而在PA、HA和NS基因上,与纽约流行株的遗传距离也小于A/Sydney/5/97.A/Zhejiang/18/98与香港或纽约株在HA1区仅存在1～3个位点的氨基酸残基不同,而与A/Sydney/5/97存在7个位点的氨基酸残基差异,其中3个位点于抗原决定簇区.各毒株间的交叉血凝抑制实验表明A/Zhejiang/18/98与A/Sydney/5/97的抗原比已达2.0,提示二者在抗原性上存在一定差异.此外,1997-1998年H3N2各地流感流行的起始时间序列,也显示了该次流感传播的可能途径.结论 浙江省1998年H3N2流感的流行很可能是由1997年底H3N2新型流感变异株经纽约和香港输入中国大陆所导致.     

2005年浙江麻疹流行株与疫苗株基因组比较分析

目的 通过对麻疹暴发疫情中分离的麻疹流行株MVi/Zhejiang.CHN/7.05/4与麻疹疫苗株沪191全基因组比较,分析当代麻疹流行株与疫苗株的基因差异.方法 通过测定从2005年浙江省麻疹暴发疫情中分离到的麻疹流行株MW/Zbejiang.CHN/7.05/4的全基因组序列,采用MEGA 3.1软件对流行株与疫苗株的全基因组序列进行比对和分析,并结合流行病学资料对毒株的变异进行分析.结果 流行株与疫苗株相比全基因组共发生822个碱基突变(变异率为5.17%),含161个异义突变,其中有3个变异位点导致了病毒糖基化位点的变异;用毒株制备抗血清进行交叉中和试验,流行株与疫苗株抗原比相差5.66倍.结论 浙江省2005年麻疹暴发疫情分离的流行株MVi/Zhejiang.CHI/7.05/4和中国现行使用的麻疹疫苗株沪191在全基因组层面已存在一定的差异,疫苗对免疫人群的保护作用需做进一步追踪探讨.     

浙江省2008-2009年三起诺如病毒胃肠炎暴发的病原分子特征分析

Objective To study the molecular characteristic of norovirus in 3 outbreaks of gastroenteritis in Zhejiang province. Methods During January 2008 and December 2009, fecal specimens of patients were collected from 3 outbreaks of acute viral gastroenteritis. Noroviruses were detected by Real-time RT-PCR. Part of the positive samples were randomly selected and detected by RT-PCR. PCR products were sequenced. Sequence analysis was undertaken based on partial sequence of RNA dependent RNA polymerase(RdRp)and capsid protein gene. Some positive samples were amplified by 3' RACE(rapid amplification of cDNA 3' ends), 3200 bp in length. The exact whole ORF2, ORF3 and 3' untranslation regions(UTR)gene of norovims were identified. Results There were in total 3 outbreaks of viral gastroenteritis caused by norovirus being reported. A total of 62 stools were obtained from cases with acute gastroentefitis. Noroviruses were detected in 41 cases including 27 strains of genogroup Ⅰ norovirus and 9 strains of genogroup Ⅱ norovirus, 5 strains of genogroup Ⅰ + Ⅱ norovirus. Four genotypes including G Ⅰ .8, G Ⅱ .b, G Ⅰ .2/0 Ⅰ .6 recombination together with co-infection of G Ⅰ .8 and G Ⅱ .b were detected. Conclusion Norovirus was confirmed as the major cause of outbreaks of viral gastroenteritis in Zhejiang province and multiple genotype of norovirus were identified from the outbreaks. It was the first time to have found a recombinant of G Ⅰ .6 capsid and G Ⅰ .2 polymerase norovims as well as the co-infection of G Ⅰ .8 and G Ⅱ .b norovirus in the same sample.     

多重逆转录-聚合酶链反应检测麻疹风疹流行性腮腺炎病毒基因的研究

目的　探索麻疹、风疹、流行性腮腺炎 (腮腺炎 )病毒感染的快速诊断方法。方法　利用多重逆转录 聚合酶链反应 (MRT PCR)方法对麻疹、风疹、腮腺炎病毒的相关基因检测进行研究。结果　直接从麻疹疫苗沪1 91 株 ,风疹疫苗BRDⅡ株 ,腮腺炎疫苗S79株 ,冻干麻疹、腮腺炎、风疹联合减毒活疫苗及临床麻疹、风疹、腮腺炎患者的标本中 ,同时检测出麻疹、风疹、腮腺炎病毒 6 3 5bp、4 1 1bp、5 1 9bp的特异性核酸片段 ,MRT PCR 1次扩增灵敏度均可分别达到 1TCID50 。结论　该方法能特异、敏感地检测临床标本中麻疹、风疹、腮腺炎病毒 ,是快速诊断麻疹、风疹、腮腺炎病毒感染的理想方法     

荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法快速检测甲1型流行性感冒病毒核酸

目的建立特异、快速、敏感的TaqMan荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,用于检测甲1型流行性感冒(流感)病毒核酸.方法在甲1型流感病毒血凝素基因的保守区设计引物和TaqMan探针,对其进行筛选,同时对荧光定量RT-PCR反应条件和反应体系进行优化,验证该方法的特异性、敏感性、重复性,并对疑似流感患者含漱液标本进行检测.结果该方法对甲1型流感病毒的检测具有高度的特异性,对甲3型流感病毒、乙型流感病毒、禽流感病毒H5、严重急性呼吸道综合征病毒、麻疹病毒及其它呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.1TCID50.采用该方法从临床疑似患者含漱液中对甲1型流感病毒核酸的检出,比采用狗肾传代细胞进行病毒分离更为敏感.从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重复性好,且大大减少了常规RT-PCR检测产物的污染机会.结论新建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测甲1型流感病毒的特异、敏感的方法,非常适合于疑似流感爆发疫情的应急诊断和鉴别诊断.     

荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测乙型流感病毒核酸.方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在乙型流感病毒核蛋白(NP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针进行筛选,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度.此外还对疑似乙型流感含漱液标本进行检测.结果该方法对乙型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、甲3型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01 TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右.结论本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测乙型流感病毒特异、敏感的新方法.     

多重逆转录-聚合酶链反应对甲1与甲3型流行性感冒病毒神经氨酸酶亚型的快速鉴定

为建立流行性感冒 (流感 )病毒甲1、甲3 型神经氨酸酶 (NA)N1与N2 亚型的快速鉴别方法 ,通过对大量NA基因序列的比较 ,分别在N1与N2 亚型的保守区域设计特异性引物 ,采用多重逆转录 聚合酶链反应 (MRT PCR)进行NA基因扩增 ,并评价了其灵敏度和特异性。结果表明 :MRT PCR能特异性扩增甲1、甲3 型流感病毒NAN1与N2 亚型基因 ,灵敏度为 0 1TCID50 ,可从临床患者含漱液中直接检测到N1、N2 基因。MRT PCR方法不仅可作为甲型流感病毒NA亚型的快速鉴定方法 ,而且可以作为人类甲型流感病毒基因快速诊断方法的补充 ,应用于流感爆发疫情的应急诊断。     

限制性酶切片段长度多态性分析用于乙型流行性感冒病毒巴拿马株与维多利亚株的快速鉴定

利用限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)鉴别乙型流行性感冒(流感)病毒的巴拿马株与维多利亚株,对乙型流感病毒血凝素(HA)基因采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增后,用HindⅢ做酶切反应并进行琼脂糖凝胶电泳.结果显示:乙型流感病毒维多利亚株或巴拿马株HA基因均能被特异性引物所扩增,且与甲1与甲3型流感病毒无交叉反应.该片段经HindⅢ酶切后,乙型流感病毒巴拿马株在电泳谱上出现603bp与242bp的2个片段,而乙型流感病毒维多利亚株在该片段无HindⅢ酶切位点,仍呈872bp的一个片段.表明该方法不仅可作为常规血清学方法的补充,对乙型流感病毒维多利亚株与巴拿马株作出正确判定,而且可快速敏感地从临床标本中直接对两类乙型流感毒株进行鉴别.