HCMV pp65和gB联合核酸疫苗表达载体的构建及其体内生物学活性研究

人巨细胞病毒(HCMV)主要被膜磷蛋白pp65(phosphoprotein 65)及糖蛋白gB(glycoprotein B)在病毒感染及诱发机体免疫反应中起重要作用，近年来有不少学者对HCMV pp65和gB这两种抗原进行动物和临床试验研究，虽取得了一定效果，但仍存在免疫原性弱、免疫范围局限等缺点。本研究利用分子生物学方法将HCMV两种保护性免疫原性基因pp65和gB构建在一起，制备HCMV核酸疫苗，并研究其在小鼠体内的免疫活性。     

端粒及端粒酶研究的新进展

端粒是染色体末端高度保守的重复核苷酸序列，对染色体具有保护作用，随着细胞分裂的不断进行，端粒逐渐缩短，减少到一定程度，细胞就趋向衰亡，被认为是细胞有丝分裂的“生物钟”。端粒酶是影响端粒长度的主要因素，以其ＲＮＡ为模板，向端粒末端添加（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ序列，使端粒延长，从而延长细胞的寿命甚至使其永生。端粒酶的功能区主要在ｈＴＲ的４４－２０３核苷酸区，３ｐ和１０ｐ上存在着编码调整端粒酶的基因，Ｅｓｔｌ可能是端粒末端结合蛋白，是端粒酶的识别位点。正常情况下，此酶活性较低或无活性，但在干细胞、永生型细胞或肿瘤细胞此酶活性较强。端粒酶的活性主要与细胞分裂速度、细胞周期因素及细胞分化程度有关，细胞分化程度低、细胞增生活跃及肿瘤细胞在Ｓ期时活性较高。在恶性肿瘤中端粒酶活性较高，但在良性肿瘤和非肿瘤中活性较低，因而可利用ＴＲＡＰ技术对端粒酶活性进行检测来进行肿瘤诊断及良恶性鉴别。同时可利用端粒酶抑制剂能抑制端粒酶的活性，缩短端粒，使恶化细胞良转，达到治疗肿瘤的作用，而且还可利用检测端粒酶作为治疗效果好坏的指标。     

IL-1ra对IL-1β诱导子宫内膜异位症在位内膜基质细胞分泌RANTES的拮抗作用研究

目的 :研究IL -1受体拮抗剂 (IL -1ra)对IL- 1β介导的细胞生物学功能的影响 ,为基因工程药物IL- 1ra用于妇产科临床提供理论依据。方法 :取培养 3～ 5代的子宫内膜异位症的基质细胞分别加入不同浓度的IL -1β与IL- 1ra ,用ELISA双抗体夹心法测定细胞培养上清液中RANTE的含量。结果 :IL -1β作用后 ,EMs在位内膜基质细胞培养上清液中的RANTES含量明显增高 (P <0 .0 1)。当用一定浓度的IL 1ra封闭IL -1受体后加用IL -1β ,细胞培养上清液中RANTES含量呈降低趋势 ,结果有统计学意义 (P <0 .0 5 )。 结论 :IL- 1ra有拮抗IL- 1β诱导EMs在位内膜基质细胞分泌RANTES的作用。     

宫颈癌细胞系中hTERT启动子水平及其与端粒酶活性相关性的研究

目的:探讨宫颈癌细胞系中人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子的活性及其与hTERT mRNA表达和端粒酶活性之间的关系。方法:应用脂质体转染法将hTERT核心启动子基因转入宫颈癌细胞系Hela和正常人皮肤表皮细胞中,并用荧光素酶检测实验检测其中hTERT启动子的活性;应用RT-PCR半定量法检测2种细胞中的hTERT mRNA表达水平:应用PCR-ELISA定量检测这2种细胞中的端粒酶活性。同时以端粒酶阳性的永生化人胚肾成纤维细胞系HEK293的检测结果作为阳性对照,以端粒酶阴性的人胚肺成纤维细胞系HELF的检测结果作为阴性对照。结果:宫颈癌细胞系HeLa和正常人皮肤表皮细胞中的hTERT启动子活性(视每种细胞中pGL3一control的启动子活性为100％)分别为20.1％和0.3％;hTERT mRNA相对表达水平分别为0.63和0(视HEK293表达水平为1):端粒酶活性分别为0.393和0.144(视>0.2为阳性)。结论:宫颈癌细胞系中hTERT启动子活性、hTERT mRNA表达水平和端粒酶活性均特异性增高,而正常皮肤表皮细胞中则受抑制或不表达。hTERT启动子活性水平与hTERT mRNA表达水平及端粒酶活性之间有显著相关性。     

树突状细胞体外高效诱导白血病特异性细胞毒性T淋巴细胞生成

[目的]研究体外诱导产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)及其抗白血病反应.[方法]应用mGM-CSF及mIL-4细胞因子从小鼠骨髓细胞扩增出成熟树突状细胞(DC),使其负载冻融法制备的白血病细胞相关抗原(TAA),通过观察DC诱导的白血病特异性CTL的免疫表型,MTT分析其对于L7212细胞的抑制率,利用ELISA评价IL-2和IL-4水平.[结果]骨髓单个核细胞经mGM-CSF、mIL-4的联合作用7天后光镜及扫描电镜下观察到大量成熟DC生成.经负载TAA的DC活化后T细胞中CD3 、CD8 、CD25 细胞明显增多.FCM显示CD3 、CD8 、CD25 T细胞显著增多,CD8 细胞多于CD4 细胞.活化后T细胞对L7212细胞有特异性杀伤活性,在效靶比为50:1培养72 h后杀伤率达90.1%±2.7%.DC与T细胞共培养上清中IL-2的分泌水平为4.656±0.62pg/ml,明显高于普通T细胞培养组的1.436±0.11pg/ml(P=0.011),IL-4水平则无明显变化(P＞0.05).[结论] mGM-CSF及mIL-4配伍诱导生成的DCs经L7212冻融抗原负载后可在体外高效诱导白血病特异性CTL生成.     

氟化物对限制性内切酶酶切活性改变的研究

目的 :探讨氟化物对限制性内切酶酶切作用改变的影响。方法 :常规方法提取纯化PBR32 2质粒 ;将NaF与PBR32 2质粒 37℃共同作用 1h ,再用限制性内切酶BamH1 对PBR32 2质粒进行酶切 3h ,同时将NaF作用的PBR32 2用层析柱纯化后再进行酶切反应 ;将酶切产物进行电泳 ,观察结果并拍照。结果 :随着NaF浓度的增加 ,BamH1 对PBR32 2的酶切作用减弱 ,当加入 5mmol LNaF时 ,BamH1 几乎无酶切活性 ,而对加入 5mmol LNaF的PBR32 2用层析柱进行纯化 ,以除去NaF ,再对其进行酶切 ,可完全切开。而且氟离子可导致酶切片段在电泳中显示拖尾现象。结论 :氟化物可抑制限制性内切酶的酶切活性     

重组人IL-18的基因克隆与表达的研究

目的：利用基因重组技术构建人IL-18(rhIL-18)的真核表达载体，并在大肠杆菌中表达。方法：利用RT-PCR技术从外周血细胞扩增得到IL-18的cDNA并测定其核酸序列。将扩增产物酶切后克隆到pORF5质粒的Nco Ⅰ／Nhe Ⅰ 酶切位点，转化大肠杆菌JM109，筛选阳性重组子，构建真核表达质粒pORF5-hIL-18。结果：真核表达质粒pORF5-hIL-18在大肠杆菌JM109表达，能够诱导PBMC合成GMCSF，具有协同rhIL-2增强NK细胞细胞毒作用的能力。结论：重组表达的rhIL-18具有生物活性，可用于进一步的功能研究。     

CA125,CA19—9检测在卵巢癌诊断及治疗中的价值

应用酶联免疫（ＥＬＩＳＡ）方法进行ＣＡ１２５、ＣＡ１９－９检测,结果显示ＣＡ１２５在卵巢术前患者中灵敏度为８７．５％,特异度为９０％,准确率为８８．７１％,明显高于其它疾病;卵巢癌术后ＣＡ１２５数值明显下降,与术前相比有显著性差异;ＣＡ１２５与ＣＡ１９－９联检可提高卵巢癌检出率。     

血清CYFRA21-1在肿瘤诊断中的临床价值

目的 :探讨CYFRA2 1 1在肺癌、喉癌和消化道肿瘤中的诊断价值。方法 :应用酶联免疫方法对82例肺癌、18例喉癌和 74例消化道肿瘤测试血清CYFRA2 1 1水平。结果 :①肺癌CYFRA2 1 1阳性率为 79.3% ,特异性为 92 .5% ,准确率为 83.6 % ,明显高于其他肿瘤 ;②肿瘤转移患者血清CYFRA2 1 1水平明显高于未转移患者 ;③肺癌治疗前后血清CYFRA2 1 1水平有显著差异 ,治疗后明显下降 ;④非小细胞肺癌血清CYFRA2 1 1水平明显高于小细胞肺癌。结论 :CYFRA2 1 1是诊断肺癌 ,特别是非小细胞肺癌 ,以及观察疗效的一项极有价值的指标。     

HPV16L1-E7重组腺病毒在SCID-Hu IC小鼠和HPV16阳性肿瘤联合嵌合小鼠中防治作用的研究

目的　建立SCID HuIC小鼠动物模型和HPV16阳性肿瘤联合嵌合模型 ,研究HPV16L1 E7重组腺病毒在SCID HuIC小鼠和肿瘤联合嵌合模型中的防治作用。方法　①实验组SCID小鼠移植人胎儿多组织 ,对照组注射RPMI 16 4 0培养液 ,8周末检测人IgG抗体 ,人CD4 5、CD3、CD19;②T1和C1组先注射HPV16L1 E7重组腺病毒 ,2周末强化 ,4周末接种CaSki细胞 ;T2和C2组先接种CaSki细胞 ,4周末注射HPV16L1 E7重组腺病毒 ,6周末强化。 8周末检测病毒特异性IgG抗体、人IFN γ及T淋巴细胞增殖 ,测定肿瘤的物理指标以及免疫组化实验。结果　①实验组人IgG抗体阳性率 90 .0 % (18/ 2 0 ) ,CD4 5为 (49.79± 39.18) % ;CD3为 (42 .2 7± 36 .37) % ;CD19为 (9.2 8±7.4 6 ) % ,对照组人IgG抗体、人CD4 5、CD3及CD19均为阴性 ;②T1和T2组病毒特异性IgG抗体均为阳性、人IFN γ的含量和T淋巴细胞增殖实验 ,病毒特异性蛋白刺激组均高于非刺激组 (P <0 .0 5 ) ,C1和C2组病毒特异性IgG抗体为阴性、人IFN γ的含量及T淋巴细胞增殖均为阴性 ;肿瘤形成率 :T1和T2组分别为 0和 70 .0 % (7/ 10 ) ,而C1和C2组均为 10 0 % ;肿瘤大小 :T2组在 4周末时为 (4.35 5±0 .387)mm3 ,8周末为 (10 2 8± 90 .96 )mm3 ,C2组在 4周末时为 (32 .75± 6 .717)mm3