多药耐药基因启动子高表达载体的构建与鉴定

目的克隆多药耐药基因(MDR1)启动子,构建并鉴定真核表达载体pcDNA3-MDR1启动子.方法采用PCR方法从白血病多药耐药K562-AO2细胞中扩增MDR1 启动子,克隆入T载体,酶切后与pcDNA3连接,电泳及DNA测序进行鉴定.结果 PCR克隆出 MDR1启动子,成功克隆入T载体,DNA测序证实序列正确,通过连接成功构建含正确目的基因的表达载体pcDNA3 -MDR1启动子.结论成功构建了MDR1启动子高表达载体,为靶向治疗耐药肿瘤构建载体提供了实验基础.     

热处理与顺铂、5-FU联用对人卵巢癌细胞株的生长抑制作用

目的:探讨不同温度热处理对顺铂(DDP)、5-氟尿嘧啶(5-FU)及其各种联用方式对人卵巢癌细胞株3A0生长的抑制作用。方法:采用细胞培养及MTT方法检测在41、43及45℃温度条件下全量、半量DDP和5-FU及各种联用方式对3A0细胞株的生长抑制作用。结果:温度升高可显著抑制3A0细胞生长,且呈明显的温度依赖性;热处理可显著增强DDP及以DDP为主的联合化疗药物组的细胞生长抑制效果;43℃热处理对5-FU有一定的增强效应。热处理后DDP和5-FU的各种全量和半量联用方式均可达到同温度下全量DDP的细胞抑制效果。结论:DDP和5-FU联合应用及各种联用方式对人卵巢癌3AO细胞均有明显的杀伤作用,热处理可显著增强其杀伤作用。     

联合转染mdrl和mcll基因短发夹RNA干扰表达质粒逆转K562/A02细胞耐药的实验研究

目的构建针对 mdrl 和 mell 基因的短发夹 RNA(shRNA)干扰表达质粒,并探讨联合转染对 K562/A02细胞耐药的逆转作用。方法根据 mdrl 和 mell 基因表达序列设计有效的 RNA 干扰片段,分别将其构建入质粒表达空载体中,以获得两种基因特异性 shRNA 干扰表达质粒;然后在脂质体介导下分别和联合转染 K562/A02细胞,用 G418和(或)Hygro B 筛选出稳定表达的细胞克隆。用RT-PCR 分析 mdrl 和 mcll mRNA 的表达;MTT 法检测阿霉素对 K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC_(50));流式细胞术测定细胞 P-糖蛋白表达水平以及细胞凋亡率。结果成功构建两个基因的 shRNA干扰表达质粒。mdrl、mell shRNA 干扰表达质粒单独和联合转染 K562/A02细胞可有效封闭相应基因表达,联合转染组 mdrl 基因和 mell 基因的 mRNA 相对表达水平分别是未转染细胞的52%,44%。mdrl、mell shRNA 干扰表达质粒单独和联合转染后 K562/A02细胞耐药逆转率分别为63.8%,71.1%,83.1%,转染两种质粒组对 K562/A02细胞耐药逆转率最高,P 糖蛋白相对表达量由未转染组的19.70±1.15降至6.40±0.92(P<0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率由(1.53±0.42)%提高至(7.77±0.42)%(P<0.01)。联合转染两种质粒组和单独转染组比较,细胞对阿霉素敏感性和阿霉素诱导的细胞凋亡率差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论转染 mdrl 或 mell 基因的 shRNA 干扰表达质粒可有效抑制相应基因表达,皆不同程度逆转 K562/A02细胞对阿霉素的耐药性;联合转染两种质粒可显著增加逆转耐药的效果。mell 基因可能与 K562/A02耐药相关。     

IL-18及其受体在特发性血小板减少性紫癜患者Th1类细胞优势应答中的作用

目的 探讨白细胞介素18(IL-18)及其受体(IL-18R)在特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者Th1类细胞因子优势应答中的作用.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测15例活动期和18例缓解期ITP患者外周血单个核细胞(PBMNC)中转录因子T-bet和GATA-3 mRNA的表达;应用ELISA法检测血浆中IL-18的变化;应用流式细胞术检测CD3+细胞和淋巴细胞表面IL-18R的表达.13名健康志愿者为正常对照.结果 ITP活动期患者PBMNC中T-bet mRNA表达水平(0.069±0.013)明显高于对照组(0.019±0.010)(P＜0.05),而GATA-3 mRNA的表达水平(0.002±0.001)明显低于对照组(0.005±0.002)(P＜0.05);血浆IL-18和CD3+细胞表面IL-18R表达水平较ITP缓解期患者和对照组显著增高.ITP缓解期患者T-bet与GATA-3 mRNA表达水平与对照组比较差异均无统计学意义(P值均＞0.05),T-bet/GATA-3比例基本恢复正常,血浆中IL-18和CD3+细胞表面IL-18R的表达水平也基本恢复正常.结论 ITP活动期患者表现为Th1优势应答,T-bet/GATA-3比例明显失衡,T-bet/GATA-3比例可作为ITP患者Th1类细胞极化的敏感指标;ITP活动期患者IL-18和IL-18R表达上调,可能为ITP患者的治疗提供一个新的治疗靶点.     

定量检测BCR-ABL(P210)转录本水平室内质控体系的完善及多中心推广应用北大核心CSCD

目的建立完善的BCR-ABL(P210)监测室内质控体系, 确保检测结果的长期稳定性和室间可比性, 并在3家医院进行推广应用。方法山东大学齐鲁医院血液病研究室(H1)利用实时定量PCR(RQ-PCR)检测质控物的BCR-ABL(P210)转录本水平, 完善质控体系的可靠性和稳定性;赴其他3家医院(H2~H4)现场进行测定前质量控制检查, 同时邮寄给各家医院25套质控物进行检测;采用Levey-Jennings质控图结合Westgard多规则方法, 对各家医院的标准曲线斜率、截距及检测结果进行统计学的质量判断, 作出质控评价。结果①成功建立并完善了测定前质控检查、测定中质控统计判断、测定后质控评价的BCR-ABL(P210)转录本水平监测的室内质控体系。②4家医院标准曲线的斜率、截距均在控。③多中心质控物判断结果:H1医院中、低浓度质控物各出现1次12s警告, 判断为在控;H2医院3种浓度质控物各出现1次12s警告, 判断为22s失控;H3医院高浓度质控物违反1次13s规则, 低浓度质控物出现1次12s警告, 判断为13s失控;H4医院各质控物均在控。④质控评价及纠正:2家医院在控, 另2家医院各出现1次失控, 查找原因进行纠正后未再出现失控。⑤多中心质控物原始数值比较:4家医院之间高浓度质控物结果差异有统计学意义, 中、低浓度质控物结果差异无统计学意义。⑥多中心质控物国际标准值(IS值)比较:H2、H3医院的IS数值显著高于H1医院, H2医院显著高于H3医院。结论建立了一套完善稳定的BCR-ABL(P210)转录本室内质控体系, 有效地保证临床检测结果的稳定性和室间可比性, 并成功完成了多中心的推广应用。     

C6胶质瘤细胞多药耐药基因启动子靶向的双自杀基因表达载体的构建及鉴定

目的克隆多药耐药基因（MDRl）启动子，构建并鉴定MDR-1启动子靶向的CD、TK双自杀基因表达载体。方法提取耐药胶质瘤细胞株C6／ADR的基因组DNA，通过PCR方法选择性扩增多药耐药MDRl启动子片段，连接到T载体上，酶切后定向克隆入pcDNA3．TK载体上的CMV启动子位置，然后从pcDNA3．CD．TK上酶切下CD片段并插入上述载体形成pcDNA3．MDR1P．CDTK，通过电泳及DNA测序对其进行鉴定。结果通过PCR方法扩增出了MDR1启动子片段，并连接到T载体上，然后成功克隆入pcDNA3．TK中，形成pcDNA3．MDR1P．TK，将pcDNA3．CD．TK上的CD基因切下后插入pcDNA3．MDR1P．TK，电泳及DNA测序证实连接准确。结论成功构建了含正确MDR1启动子靶向的双自杀基因表达载体pcDNA3．MDR1P．CDTK，为今后靶向治疗耐药肿瘤构建载体提供了实验基础。     

抑制血小板聚集功能的抗血小板膜糖蛋白GPⅡbⅢa自身抗体的筛选

目的：筛选出血浆中含有抑制血小板聚集的血小板膜糖蛋白GPⅡbⅢa自身抗体的血小板减少性紫癜(ITP)患者，为人源化抗GPⅡbⅢa基因工程抗体的研制做准备。方法：用改良MAIPA法检测24例慢性ITP患者血浆有无血小板膜糖蛋白GPⅡbⅢa自身抗体，用血小板聚集试验研究抗GPⅡbⅢa自身抗体对血小板聚集的影响。结果：24例慢性ITP患者中10例(41．7％)血浆中抗GPⅡbⅢa自身抗体阳性，2例明显抑制血小板聚集功能。结论：少数抗GPⅡbⅢa自身抗体可抑制血小板聚集功能。     

CD-TK融合自杀基因对前列腺癌细胞的杀伤作用

目的：探讨CD-TK融合自杀基因体系对前列腺癌PC-3m细胞的杀伤作用。方法：应用逆转录病毒载体将CD-TK融合基因转染PC-3m细胞，经RT-PCR鉴定后，用MTT法检测丙氧鸟苷(GCV)、5-胞嘧啶(5-FC)前体药物单一或联合应用对转染PC-3m细胞的杀伤作用，以未转染PC-3m细胞为对照。同时应用流式细胞仪、电镜等检测药物作用前后的变化。结果：GCV对转染PC-3m细胞有较强的直接细胞毒作用，而5-FC治疗有显著旁观者效应；联合用药具有协同作用。结论：CD-TK融合基因治疗对前列腺癌细胞具有显著杀伤作用，明显优于单一自杀基因治疗，深入研究意义较大。     

CDglyTK自杀基因系统治疗小鼠慢性粒细胞白血病皮下移植瘤的研究

为了探讨逆转录病毒介导的CDglyTK自杀基因系统时K562细胞的体内外杀伤作用，将逆转录病毒介导的CDglyTK自杀基因转染入K562细胞，体外实验用MTT法观察5-氟胞嘧彰丙氧鸟苷（5-fluorocytosine／ganciclovir，5-FC／GCV）时K562／CDglyTK细胞的生长抑制率。体内实验时将K562／CDglyTK细胞和K562细胞接种于裸鼠皮下，使用GCV和5-FC后，观察裸鼠肿瘤体积的变化及裸鼠的生存率。体外实验表明，GCV联合5-FC时K562／CDglyTK细胞具有明显的杀伤作用；体内实验结果显示，皮下注射K562细胞和K562／CDglyTK细胞后小鼠成瘤率无明显区别；使用5-FC／GCV可明显抑制裸鼠体内的肿瘤形成；经5-FC／GCV治疗后K562／CDglyTK组的肿瘤体积较对照组明显缩小，裸鼠生存率也较时照组明显提高。结论：双自杀基因在体内外对K562细胞均有杀伤作用。     

白藜芦醇联合顺铂对FRH-0201细胞的影响

目的：探讨白藜芦醇（RES）与顺铂（DDP）联合应用对肝门部胆管癌细胞系FRH-0201的影响。方法：不同浓度的RES、DDP单独及联合作用FRH-0201细胞不同的时间,光学显微镜观察细胞形态学变化;MTT比色法和集落形成实验检测细胞增殖抑制作用;流式细胞术检测细胞周期改变及细胞凋亡率。结果：RES在5～320μmo/lL浓度范围内能够抑制FRH-0201细胞的增殖,并呈剂量-时间依赖关系,其作用24、48和72h的IC50分别为55.35、32.84和28.01μmol/L。RES＋DDP联合应用的细胞抑制率和诱导凋亡率较二者单独作用显著升高（P〈0.05）。结论：RES对FRH-0201细胞具有抑制作用,RES＋DDP联合应用具有协同作用。