溺死相关硅藻rbcL基因检测技术研究

目的：筛选硅藻叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基（large subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase oxyge－nase,rbcL）基因的特异性引物,建立溺死尸体组织内硅藻rbcL基因的聚合酶链式反应-毛细管电泳（polymerase chain reaction-capillary electrophoresis,PCR-CE）检测方法,探讨在溺死诊断中的应用价值。方法：采用荧光标记引物扩增硅藻rbcL基因,对21种标准藻株、5种浮游水生标准菌株、3种人体共生标准菌株和人类DNA扩增产物进行PCR-CE检测,验证引物特异性和灵敏度。检测溺死尸体组织样本中硅藻,并比对微波消解-真空抽滤-自动扫描电镜法（microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy,MD-VF-Auto SEM）检测结果。结果：使用引物ND-rbcL对21种标准藻株、5种浮游水生标准菌株、3种人体共生标准菌株和人类DNA进行扩增,其中舟形藻、菱形藻、小环藻、变异直链藻、针杆藻和骨条藻6种硅藻的CE检测结果为阳性,DNA片段为197 bp,其他为阴性。6种硅藻DNA检测阳性的灵敏度分别为0.502、0.117、0.029、0.042、0.275和0.215 ng（20 μL扩增体系）。PCR-CE方法检测35例尸体（3例陆地正常死亡尸体,2例水中发现非溺死尸体,30例溺死尸体）的组织样本,肺脏、肝脏和肾脏硅藻检出率分别为100%、63.3%和53.3%,检测总阳性率为83.3%。当溺水死亡尸体脏器组织内硅藻含量>10个/10 g时,使用MD-VF-Auto SEM方法检测,其检测总阳性率为100%,PCR-CE方法检测,其检测总阳性率为92.6%,两者对检测溺死尸体脏器中硅藻阳性率无统计学差异（ ?字2=2.077,P=0.491）;当硅藻含量<10个/10 g时,PCR-CE方法检测为阴性,与MD-VF-Auto SEM方法检测溺死尸体各种脏器中硅藻阳性率具有统计学差异（P<0.05）。结论：基于ND-rbcL引物建立的PCR-CE法能快速检测硅藻rbcL基因,所需检材量小,易于推广,在溺死诊断中有较好地应用前景。