siRNA干扰胰岛新生相关蛋白表达对胰岛细胞株INS-1细胞增殖的抑制作用

目的 探讨靶向胰岛新生相关蛋白(INGAP)基因RNAi对胰岛细胞增殖的抑制效应.方法 设计合成siRNA,通过脂质体转入胰岛细胞株INS-1中,研究其对靶基因的抑制效应,采用逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、流式细胞仪、Western-blot法分别检测转染后的INS-1细胞中INGAP mRNA和蛋白表达的变化,用噻唑蓝(MTT)法来检测细胞的增殖.结果 结果显示siRNA6序列对细胞增殖有明显的抑制效应,INGAP mRNA及蛋白表达明显降低,INS-1细胞增殖受到抑制,P<0.05.结论 干扰INGAP基因的表达能有效抑制胰岛细胞的增殖,INGAP有可能成为治疗β细胞严重减少或损害的重要新靶点.

Abstract：

Objective To investigate the effect of small interfering RNA (siRNA)-mediated islet neogenesis associated protein (INGAP) gene silencing on the proliferation of islet cells. Methods Different siRNAs targeting INGAP gene were designed and transfected into INS-1 islet cells, and the expression levels of INGAP mRNA and protein following the transfection were detected using RT-PCR, flow cytometry and Western blotting. The proliferation of the transfected INS-1 cells was evaluated using MTT assay. Results Compared with those in the irrelevant siRNA, empty vector control, and un-transfected groups, the expression levels of INGAP mRNA and protein in the cells transfected with siRNA6 were reduced significantly. The cell proliferation rate significantly increased after transfection with siRNA6 (P<0.05). Conclusion siRNA targeting INGAP can effectively down-regulate INGAP expression and inhibit the proliferation of INS-1 cells.     

人胰岛新生相关蛋白基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

目的 在毕赤酵母中分泌表达具有生物学活性的重组人胰岛新生相关蛋白(rhINGAP),用于INGAP的生理功能研究和动物试验.方法 通过PCR扩增INGAP基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列的Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点处,再将融合基因αINGAP重组到表达质粒pPIC9K的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ之间,Sal Ⅰ酶切线性化重组质粒INGAP/pPIC9K,电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的 基因INGAP,甲醇诱导rhINGAP的表达,SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的 蛋白,用ELISA定量测定生物学活性.结果 成功构建了重组表达质粒INGAP/pPIC9K,筛选得到3个阳性转化子,表达产物具有良好的抗原活性.结论 实现了rhINGAP在毕赤酵母中的高效分泌性表达.     

益活清胰汤对大鼠重症急性胰腺炎心肌损伤的影响

[目的]研究益活清胰汤对大鼠重症急性胰腺炎(SAP)心肌损伤的影响.[方法]45只SD大鼠建立SAP模型,随机分为治疗组、对照组、正常组,测定6、12、24 h血淀粉酶(AMY)、脂肪酶(CIP)、肌酸激酶同工酶(CIK-MB)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、心肌肌钙蛋白(CTn1).[结果]术后6 h大鼠心电图T波、ST段均有异常改变,血AMY、CIP、CK-MB、TNF-α、IL-6、CTn1呈进行性升高.治疗组用药后ECG T波、ST段下移,与对照组相比P＜0.01;血AMY、LIP、CK-MB、TNF-α、IL-6、CTn1明显下降,与对照组相比P＜0.01.[结论]TNF-α、IL-6可能是介导SAP心脏功能障碍的重要递质,监测TNF-α、IL-6、CTn1可能有预防SAP心肌损伤的作用,益活清胰汤能降低TNF-α、IL-6的表达,是治疗SAP心肌损伤较为理想的药物.     

重组葡激酶对重症急性胰腺炎大鼠心肌损伤的治疗作用

[目的]研究重组葡激酶(r-Sak)对大鼠重症急性胰腺炎(SAP)的发展及心肌损伤的干预作用,探讨其作用机制.[方法]63只SD大鼠随机分为假手术(A)组(n=9),模型对照(B)组(n=27),r-Sak治疗(C)组(n=27).SAP模型采用5%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射方法建立.ELISA法测定6、12、18 h各时点血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)及心肌肌钙蛋白(CTn1)水平,免疫组化法检测术后6、12、18 h各时点心肌核转录因子-κB(NF-κB)的活化情况,光镜及电镜下观察胰腺及心肌组织的病理变化.[结果]大鼠从术后6 h开始出现CTn1、CK-MB升高,治疗组各时点较对照组明显下降(P＜0.05).IL-6、TNF-α水平亦从术后6 h开始升高,其变化在时点上与CTn1、CK-MB的变化具有一致性,治疗组各时点与对照组相比明显下降(P＜0.05).治疗组胰腺及心肌组织的出血坏死减轻,微血管血栓的形成减少.[结论]r-Sak能减轻SAP的病变程度和心肌损伤,可能具有治疗SAP及预防心肌损伤等并发症的作用,特异性溶栓剂的应用可能成为治疗SAP的新途径.     

益活清胰Ⅰ号对重症急性胰腺炎大鼠中性粒细胞与内皮细胞黏附的抑制作用

目的观察益活清胰Ⅰ号对重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)大鼠的中性粒细胞(polymorphonuclear cell,PMN)-内皮细胞(endothelial cell,EC)黏附率及PMN表面黏附分子CD11/CD18表达的影响,探讨其治疗SAP的机理。方法81只SD大鼠随机分为假手术组(n=27)、造模组(n=27)、治疗组(n=27),SAP模型采用5%的牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射方法建立。6、12、24h分批处死动物9只采集动脉血和胰腺组织标本,测定胰腺组织的MPO活性,HE染色光镜下观察胰腺组织的病理变化。分离PMN,与体外培养的血管内皮细胞作用测定PMN-EC黏附率,ELISA法测定PMN表面CD11a/CD18、CD11b/CD18。结果与假手术组比较,造模组和治疗组术后各时点胰腺组织MPO活性、PMN-EC黏附率、PMN表面CD11a/CD18和CD11b/CD18均增高(P<0.01),治疗组术后各时点胰腺组织MPO活性、PMN-EC黏附率、PMN表面CD11a/CD18和CD11b/CD18均显著低于造模组(P<0.01)。造模组胰腺组织出血和坏死严重,治疗组的病理损伤明显减轻。结论益活清胰Ⅰ号能降低PMN表面CD11a/CD18和CD11b/CD18的表达水平,减轻PMN与EC的黏附,从而有助于减轻PMN与EC黏附所致的胰腺组织病理损伤。     

血管紧张素Ⅱ受体在增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成中的作用

背景:最新研究发现,血管紧张素Ⅱ与皮肤纤维化病变的发生和发展有关,然而有关血管紧张素Ⅱ受体在人增生性瘢痕成纤维细胞中的表达及作用鲜见报道.目的:观察血管紧张素Ⅱ 1型受体和2型受体在人增生性瘢痕成纤维细胞中的表达,并探讨它们在成纤维细胞胶原合成中的作用.设计、时间及地点:对比观察,于2006-08/2007-11在解放军广州军区广州总医院医学实验中心完成.对象:取住院患者增生性瘢痕18例,男10例,女8例,年龄19～47岁,将增生性瘢痕标本分为两组,每组各9例.正常皮肤7例,取自增生性瘢痕切除患者的正常皮肤.所有取材部位未经任何治疗,标本经无菌取材后分成2份,其中一份用40 g/L多聚甲醛固定后用于免疫组织化学检测,另一份用于成纤维细胞培养.方法:采用免疫组织化学的方法和放射性配体受体结合测定法观察人增生性瘢痕组织中成纤维细胞血管紧张素Ⅱ 1型受体和2型受体的表达,并用体外细胞培养技术观察2种受体在人增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成中的作用.主要观察指标:2种受体在增生性瘢痕组织成纤维细胞中的表达及在人增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成中的作用.结果:①在增生性瘢痕的成纤维细胞可见1型受体和2型受体表达,阳性染色信号较强.放射性配体受体结合测定法显示在培养的增生性瘢痕的成纤维细胞有1型受体和2型受体,受体密度分别为(10.69±2.15),(4.9±1.05)fmol/106个细胞.②在培养的人增生性瘢痕成纤维细胞,血管紧张素Ⅱ明显促进成纤维细胞胶原的合成,1 型受体阻断剂Valsartan明显抑制血管紧张素Ⅱ的这种促进作用,2型受体拮抗剂PD123319明显增强血管紧张素Ⅱ的这种作用.结论:在增生性瘢痕的成纤维细胞表达血管紧张素Ⅱ 1型受体和2型受体,血管紧张素Ⅱ通过激活2种受体对成纤维细胞胶原的合成产生相反的作用,血管紧张素Ⅱ产生和受体表达比例的变化可能影响瘢痕的形成和成熟.     

益活清胰Ⅰ号对重症急性胰腺炎大鼠心肌组织中细胞凋亡调节蛋白表达的影响

[目的]研究益活清胰Ⅰ号对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠心肌功能损害时细胞凋亡调节蛋白Bcl-2和Bax在心肌组织中表达的影响,并探讨其作用的机制.[方法]84只SD大鼠随机分为假手术组(正常组,n=12)、对照组(n=36)及治疗组(n=36).SAP模型采用5%的牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射方法建立.苏木精-伊红染色光镜下观察胰腺及心肌组织的病理变化,免疫组化法检测术后6、12、18 h心肌Bcl-2、Bax表达及核因子-κB(NF-κB)活化情况.[结果]治疗组胰腺及心肌组织的病理变化减轻,SAP各时间点均可见NF-κB明显活化,治疗组各时间点NF-κB活化与对照组相比均明显减弱(P＜0.01).术后6 h各组Bcl-2、Bax无显著性变化(P＞0.05),12、18 h对照组Bcl-2的表达较正常组及治疗组显著减少(P＜0.01),12、18 h对照组Bax的表达较正常组及治疗组显著增加(P＜0.01).[结论]益活清胰Ⅰ号可减轻NF-κB在心肌组织中的活化,减少SAP大鼠心肌组织Bax的表达及增强Bcl-2的表达,从而减轻心肌细胞凋亡,对SAP心肌组织具有保护作用.     

丹参对兔重症急性胰腺炎早期中性粒细胞与内皮细胞粘附机制的研究

目的:研究丹参对兔重症急性胰腺炎(SAP)早期中性粒细胞(PMN)与内皮细胞(EC)粘附作用及对血浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响.方法:将日本大耳兔24只建立兔SAP模型,随机分为丹参治疗组和对照组.分别于术前,术后即刻、2、4、8、16 h,取血分离获得PMN.与体外培养的兔血管EC作用测定PMN-EC粘附率,并测定各时点血浆TNF-α值.结果:两组术后即刻粘附率均升高,对照组术后2 h TNF-α开始升高,8 h达高峰,16 h仍高于正常;治疗组2、4、8、16 h各时点的TNF-α的值小于对照组(P<0.05).结论:丹参能降低SAP血浆TNF-α的水平,进而抑制PMN-EC粘附,改善微循环及减轻组织病理损伤.     

人胰岛新生相关蛋白基因毕赤酵母表达载体的构建

目的 构建分泌表达具有生物学活性的重组人胰岛新生相关蛋白(rhINGAP)载体毕赤酵母.方法 通过PCR扩增INGAP基因,插入到重组质粒α/pUC18的α因子信号序列处,再将融合基因αINGAP重组到表达质粒pPIC9K,Sal Ⅰ酶切线性化重组质粒αINGAP/pPIC9K.电穿孔转化毕赤酵母,营养缺陷型培养基MD和G418筛选含高拷贝表达盒的酵母转化子,PCR鉴定是否含有目的 基因INGAP,甲醇诱导rhINGAP的表达,Western blotting鉴定目的 蛋白,ELISA法定量测定其含量.结果 重组表达质粒αINGAP/pPIC9K经酶切获得758bp片段,符合α因子与INGAP片段融合的长度,筛选得到3个阳性转化子,培养上清含有与抗INGAP抗体反应的蛋白.结论 成功构建了分泌INGAP蛋白的毕赤酵母菌株.     

大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌超广谱β—内酰胺酶基因的核苷酸序列测定及分子进化研究

随着人群老龄化、器官移植手术的广泛开展、免疫抑制剂的使用 ,以及社会因素的影响 ,革兰氏阳性杆菌感染发病率有所升高。该类感染包括无芽孢革兰氏阳性菌 李斯特菌、放线菌、棒状杆菌、红斑丹毒丝菌及产芽孢革兰氏阳性菌 芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌属细菌感染。临床医师与临床微生物实验室工作者对此类感染相对较陌生 ,尚未予足够重视 ,目前也难见对革兰阳性杆菌感染的系统资料 ,实验室检测、临床诊断与治疗水平需尽快提高 ,如何认识革兰阳性杆菌感染、如何准确地进行病原学诊断、如何正确地选择治疗药物、如何恰当地进行预防 ,是当代临床…