MALDI-TOF MS在临床常见菌快速鉴定中的应用研究

目的 评价MALDI-TOF MS在临床常见细菌快速鉴定中的应用.方法 选择浙江大学医学院附属第二医院2008年12月至2009年8月分离自血液、痰液、分泌物和尿液的临床常见细菌和浙江省疾病预防与控制中心收集的沙门菌共426株.包括革兰阳性球菌76株和革兰阴性杆菌350株.采用Vitek系统将细菌鉴定到种,血清凝集试验对沙门菌和志贺菌进行血清分型.PCR扩增91株细菌的16S rDNA基因并测序,所得核苷酸序列与GenBank中的数据库进行比对,确定细菌种类.用MALDI-TOF MS对所有细菌进行快速鉴定,比较不同鉴定方法 之间的符合情况.结果 除沙门菌和志贺菌外的所有革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌的Vitek和MALDI-TOF MS两者的鉴定结果 完全符合.23株沙门菌中只有2株肠炎沙门菌鼠伤寒血清型的3种鉴定方法 结果 相符,另有1株伤寒沙门菌、3株甲型副伤寒沙门菌、1株乙型副伤寒沙门菌、1株肠炎沙门菌和1株肠炎沙门菌病牛血清型的血清凝集结果 与16s rDNA基因测序结果 相符.Vitek及血清凝集试验鉴定为福氏志贺菌的4株菌16s rDNA基因测序和MALDI-TOF MS的鉴定结果 均为大肠埃希菌.结论 MALDI-TOF MS可快速、准确地对细菌进行鉴定,具有良好的重复性,但对沙门菌和志贺菌效果不佳.     

口服Cocktail A乳酸菌制剂对人肠道乳酸菌群影响的研究

目的评价口服Cocktail A乳酸菌制剂后人肠道乳酸菌群的变化。方法用需氧和厌氧定量培养方法分离并鉴定烧伤病房中30例腹泻患者给予Cocktail A乳酸菌制剂治疗前后肠道中的细菌,并以正常健康体检者的粪便培养鉴定结果作为对照。同时对未鉴定出的细菌用16S rRNA基因进行鉴定。结果腹泻患者肠道中的菌群与健康体检者肠道中的菌群相比,乳酸菌的数量和种类少,而口服乳酸菌制剂治疗后肠道中的植物乳杆菌、明串珠球菌、戊糖片球菌、副酪蛋白乳杆菌大量增加。结论口服Cocktail A乳酸菌制剂能调节肠道的菌群失调。     

携带usp基因的尿道致病性大肠杆菌强毒株诱导HeLa细胞快速早期凋亡的研究

目的 了解致病基因在尿液分离大肠杆菌中的分布情况,分析由携带usp致病基因的尿道致病性大肠杆菌介导的HeLa细胞快速凋亡.方法 采用PCR检测6种尿道致病性大肠杆菌相关致病基因在28株尿液分离的大肠杆菌的分布;通过黏附试验和锥虫蓝染色对尿液分离的大肠杆菌进行初步致病表型筛选;采用Annexin V/PI法进一步检测大肠杆菌引起HeLa细胞早期凋亡的能力;电子显微镜观察细胞凋亡特征.结果 在28株尿液分离的大肠杆菌中,检测到usp基因阳性6株.通过致病表型筛选试验筛选到2株强致病性大肠杆菌(6N和27N),其中6N菌株携带usp基因,而27N除了没有检测到usp基因,其他致病基因与6N相同.它们可以在4 h破坏大量HeLa细胞,使HeLa死亡;流式细胞仪检测凋亡结果 显示,6N菌株在1.5 h可以诱导20.75%的HeLa细胞发生早期凋亡,而27N只有1.55%的HeLa细胞发生早期凋亡.电镜结果 从形态学证实6N菌株可以快速引起HeLa细胞发生早期凋亡.结论 携带usp基因的尿道致病性大肠杆菌可以诱导HeLa发生快速早期凋亡.     

志贺菌同源性和超广谱β-内酰胺酶基因型分析

志贺菌是具有高度传染性的肠道致病菌,每年均散发或小规模暴发流行.近年临床上分离的志贺菌对常用抗菌药物逐渐耐药,有的菌株甚至出现多重耐药[1,2].自1999年Ahamed等在印度首次发现志贺菌中存在SHV-11型广谱β-内酰胺酶以来,世界各地均有志贺菌中超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的报道[3,4],且有逐步增加的趋势.     

对亚胺培南耐药粘质沙雷菌中质粒介导KPC-2型碳青霉烯酶的研究分析

目的研究粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的分子机制。方法临床分离到1株亚胺培南耐药的粘质沙雷菌[最小抑菌浓度（MIC）为64μg／m1]。将粘质沙雷菌和大肠杆菌进行接合试验，采用琼脂稀释法检测粘质沙雷菌和接合前后大肠杆菌对药物的MIC；提取粘质沙雷菌和接合后大肠杆菌的酶粗提液进行等电聚焦电泳和三维试验；特异性PCR扩增和DNA序列分析确认引起粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的β-内酰胺酶的基因型。结果除碳青霉烯类抗生素外，粘质沙雷菌还对青霉素类、头孢菌素类和单酰胺类等抗生素耐药，对喹诺酮类和氨基糖甙类抗生素敏感；接合试验可使大肠杆菌获得与粘质沙雷菌相似的耐药谱；等电聚焦电泳显示粘质沙雷菌中存在等电点（P1）分别为6．5和6．7的两种β内酰胺酶，接合后的大肠杆菌存在PI为6．7的β-内酰胺酶；特异性PCR扩增和DNA序列分析证实PI为6．7的β-内酰胺酶为碳青霉烯酶KPC-2，其核苷酸及氨基酸序列已递交到GenBank，PI为6．5的酶有待进一步研究；在三维试验中，克拉维酸、乙二胺四乙酸（EDTA）和氯唑西林均不能抑制KPG2酶对亚胺培南的水解活性。结论首次在粘质沙雷菌中发现碳青霉烯酶KPG2，该酶是引起粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的主要原因。     

应用MRSA ID产色琼脂培养基等四种方法检测和鉴定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

目的比较MRSAID产色琼脂培养基及其他3种方法检测和鉴定甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）。方法选择临床118株葡萄球菌用（118株葡萄球菌中金黄色葡萄球菌108株，凝固酶阴性葡萄球菌10株）细菌鉴定仪鉴定到种，用MRSAID琼脂筛选法、苯唑西林平板筛选法、头孢西丁纸片法比较MRSA的检测情况，同时检测金黄色葡萄球菌的mecA基因作为金标准，同时用大肠埃希菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923，铜绿假单胞菌ATCC27853和粪肠球菌ATCC29212做干扰试验。结果金黄色葡萄球菌用PCR检测其meeA基因，共检测到80株阳性菌株；用MRSAID琼脂筛选法符合率为100％，苯唑西林平板筛选法符合率为97．5％，头孢西丁纸片法符合率为100％；有1株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）和1株凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）对MRSAID琼脂的显色有干扰，出现了浅绿色的细小菌落。用标准菌株做对照均没有生长。结论MRSAID琼脂平板可以对MRSA进行主动快速监测。     

MALDI-TOF MS在临床常见菌快速鉴定中的应用研究

目的 评价MALDI-TOF MS在临床常见细菌快速鉴定中的应用.方法 选择浙江大学医学院附属第二医院2008年12月至2009年8月分离自血液、痰液、分泌物和尿液的临床常见细菌和浙江省疾病预防与控制中心收集的沙门菌共426株.包括革兰阳性球菌76株和革兰阴性杆菌350株.采用Vitek系统将细菌鉴定到种,血清凝集试验对沙门菌和志贺菌进行血清分型.PCR扩增91株细菌的16S rDNA基因并测序,所得核苷酸序列与GenBank中的数据库进行比对,确定细菌种类.用MALDI-TOF MS对所有细菌进行快速鉴定,比较不同鉴定方法 之间的符合情况.结果 除沙门菌和志贺菌外的所有革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌的Vitek和MALDI-TOF MS两者的鉴定结果 完全符合.23株沙门菌中只有2株肠炎沙门菌鼠伤寒血清型的3种鉴定方法 结果 相符,另有1株伤寒沙门菌、3株甲型副伤寒沙门菌、1株乙型副伤寒沙门菌、1株肠炎沙门菌和1株肠炎沙门菌病牛血清型的血清凝集结果 与16s rDNA基因测序结果 相符.Vitek及血清凝集试验鉴定为福氏志贺菌的4株菌16s rDNA基因测序和MALDI-TOF MS的鉴定结果 均为大肠埃希菌.结论 MALDI-TOF MS可快速、准确地对细菌进行鉴定,具有良好的重复性,但对沙门菌和志贺菌效果不佳.     

弗劳地枸橼酸杆菌中质粒介导的KPC-2和NDM-1型碳青霉烯酶基因结构分析

目的对携带bla_(NDM-1)和bl_(aKPC-2)的弗劳地枸橼酸杆菌的碳青霉烯酶基因结构进行分析。方法收集4株耐碳青霉烯类药物弗劳地枸橼酸杆菌(CF-05、CF-17、CF-35、CF-43),琼脂稀释法测定抗菌药物敏感性;脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析细菌同源性;特异性PCR扩增和序列测定分析碳青霉烯酶耐药基因和ESBLs耐药基因、接合试验、耐药基因周围序列分析对菌株的耐药机制进行分子水平研究。结果 4株细菌仅CF-05对阿米卡星敏感,所有菌株对其他检测药物全部耐药;PFGE结果显示4株细菌不同源;特异性PCR扩增和序列分析显示2株(CF-35、CF-43)同时携带blaNDM-1和blaKPC-2、另2株(CF-05、CF-17)仅携带blaNDM-1,CF-35同时携带bla_(CTX-M-15);其中3株细菌(CF-05、CF-17、CF-43)接合成功,CF-05、CF-17接合子(CF-05-1和CF-17-1)携带bla_(NDM-1),CF-43获得2种接合子(CF-43-1携带bla_(KPC-2)、CF-43-2同时携带bla_(NDM-1)和bla_(KPC-2));分析blaNDM-1和blaKPC-2周围序列发现,4株细菌周围序列分别与国内报道携带bla_(NDM-1)和bla_(KPC-2)的肺炎克雷伯菌质粒pNDM-HN380和PK048周围序列高度相似。结论在4株弗劳地枸橼酸杆菌中检测到NDM-1型碳青霉烯酶,其中2株同时携带KPC-2型碳青霉烯酶,bla_(NDM-1)周围序列和bla_(KPC-2)周围序列与国内已知肺炎克雷伯菌相关耐药基因周围序列高度相似。     

IMP-4型金属β内酰胺酶合并膜孔蛋白OmpK36缺失引起肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素高水平耐药

目的 研究临床分离的肺炎克雷伯菌Z4和Z5对碳青霉烯类抗生素耐药的分子机制.方法 2008年从卫生部北京医院的急诊室和神经内科患者的痰标本分别分离到2株对碳青霉烯类抗生素不敏感的肺炎克雷伯菌Z4和Z5.测定菌株MIC,对菌株进行质粒接合试验、质粒消除试验、β内酰胺酶IEF分析、PCR扩增和DNA序列分析以及外膜蛋白分析.结果 亚胺培南、美罗培南和厄他培南对Z4和Z5的MIC分别为32、32和256μg/ml以及1、1和2μg/ml.接合试验可使受体菌大肠埃希菌对碳青霉烯的MIC值从≤0.062 5或0.125μg/ml上升到1或2μg/ml.PCR扩增和序列分析发现Z4产IMP-4型金属β内酰胺酶、TEM-1型和SHV-1型广谱β内酰胺酶;Z5产IMP-4、TEM-1和SHV-12型超广谱β内酰胺酶;2株细菌的转移接合子均只产IMP-4.质粒消除试验发现Z5的IMP-4质粒消除株(TEM-1和SHV-12阳性)对碳青霉烯类抗生素敏感,而Z4的IMP-4质粒消除株(SHV-1阳性)对碳青霉烯类抗生素敏感性降低(亚胺培南、美罗培南和厄他培南MIC分别为0.25、0.5和4μg/ml).Z4和Z5的blaIMP-4基因均位于大小约55 000 bp质粒的I类整合子上.外膜蛋白的SDS-PAGE和ompK35/36基因序列分析发现Z4由于ompK36基因中存在点突变(CAG突变为TAG)造成基因表达提前终止而导致OmpK36膜孔蛋白缺失.结论 质粒介导的IMP-4型金属β内酰胺酶的产生或β内酰胺酶的产生合并OmpK36膜孔蛋白缺失均可引起肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素敏感性降低,IMP-4合并OmpK36膜孔蛋白缺失则可导致肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素高水平耐药.     

沙雷菌耐药性分析及其β-内酰胺酶基因型检测

目的了解沙雷菌对临床常用抗生素的耐药性以及β-内酰胺酶的产生情况。方法采用纸片扩散法对临床分离到的325株沙雷菌进行药敏试验;三维试验对提取的沙雷菌酶粗提液进行β-内酰胺酶表型筛选;用特异性KPC引物进行PCR扩增并测序,确认黏质沙雷菌β-内酰胺酶的类型。结果沙雷菌对喹诺酮类和氨基糖苷类抗生素耐药率较低;对青霉素类、头孢菌素类、单酰胺类和含酶抑制剂等抗生素耐药率较高;对碳青霉烯类抗生素(亚胺培南)耐药率高达33.9%。特异性PCR和测序证实耐亚胺培南沙雷菌的β-内酰胺酶为KPC-2型碳青霉烯酶,三维试验中克拉维酸、EDTA和氯唑西林均不能抑制该酶对亚胺培南的水解活性。结论沙雷菌对临床常用抗生素有较高的耐药率,KPC-2酶是引起沙雷菌对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因。