不同剂量鞭毛蛋白致大鼠急性肺损伤的对比研究

目的 研究经大鼠尾静脉注入不同剂量鞭毛蛋白后,观察不同时相点急性肺损伤(acute lung injury,ALI)发生的情况,探讨其发生的可能机制.方法 240只清洁级雄性Wistar大鼠分为4组:对照组、致伤1组、致伤2组和致伤3组.对照组给予生理盐水,各致伤组分别给予5、50、500μg/kg的鞭毛蛋白,于静注后2、4、6、12、24、48 h,测定动脉血氧分压(PaO2)、肺组织湿干比值(W/D)、血清与支气管肺泡灌洗液(BALF)中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)细胞因子的含量以及观察肺组织的病理改变.结果 静注鞭毛蛋白后,在对应时相点,鞭毛蛋白注入剂量越大,大鼠PaO2越低,肺W/D越高;外周血及BALF中,细胞因子TNF-α、IL-1β含量越高;肺组织病理改变越明显.以上各指标在各对应时相点,致伤2、3组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);致伤2、3组与致伤1组间也有显著性差异(P<0.01);致伤2组与致伤3组间仅TNF-α含量比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 鞭毛蛋白可致大鼠急性肺损伤,且其具有剂量和时间的差异性.     

复合培养对低氧时肺动脉平滑肌细胞表达细胞因子的调节

目的 研究低氧对肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)白细胞介素-1β、4、10、13(IL-1β、4、10、13)活性的影响,及复合培养下肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)对其调控作用.方法 大鼠PASMCs单独培养或与PMVECs复合培养,分为正常组、低氧作用2 h(H2)、6h(H6)、12 h(H12)、24 h(H24)组,采用ELISA法测定各组培养细胞上清中IL-1β、IL-4、IL-10、IL-13的活性.结果 低氧刺激后PASMCs的IL-1β、IL-4、IL-10、IL-13活性2 h开始升高,6 h达高峰,12 h降低;各时相点复合培养组均低于对应的单独培养组(P＜0.01).结论 低氧可以激活PASMCs的IL-113、IL-4、IL-10、IL-13活性,在复合培养条件下,PMVECs对此效应具有下调性影响.     

铜绿假单胞菌PAO1株基因组中2个SOS盒序列的初步鉴定

目的 鉴定铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)PAO1株基因组中的SOS盒序列.方法 挑选铜绿假单胞菌PAO1株基因组中16个可能含有SOS盒序列的DNA片段,经PCR扩增后,用纯化的LexA表达蛋白做凝胶滞后实验;将获得的2个阳性DNA片段进一步用DNase Ⅰ足纹法进行LexA蛋白结合序列即SOS盒的鉴定;分析所获得的2个SOS盒中的回文序列,以此回文序列在PAO1基因组中进行检索,初步分析出可能的SOS盒序列和可能的调控基因.结果 通过DNase Ⅰ足纹法初步鉴定了PAO1基因组中2个SOS盒序列,即位于基因组4 052 647～4 052 662 bp位置的CTGTCTACTFATACAG序列和5 349 888～5 349 903 bp位置的CTGTATAAATAACCAC序列,分析其回文结构为"CTG…CAG",以此回文序列在基因组中进行检索,共获得了10个候选的SOS盒序列.结论 初步证实了PAO1基因组中的2个SOS盒,并获得了10条SOS盒候选序列.     

LBP抑制肽对内毒素诱导的脓毒血症小鼠的保护作用

目的 研究脂多糖结合蛋白抑制肽(P12)对内毒素脂多糖(LPS)诱导的脓毒血症小鼠TLR4、CD14及肿瘤坏死因子a(TNFa)表达和小鼠生存率的影响.方法 40只小鼠随机分为5组:对照组、内毒素血症组、低剂量P12组、中剂量P12组和高剂量P12组,每组8只.腹腔内注射LPS复制脓毒血症模型,尾静脉注射P12,蛋白定量方法 (Western blot)检测TLR4和CD14蛋白的表达,ELISA法检测小鼠血清中TNF-a的含量.结果 抑制肽组TLR4和CD14蛋白的OD值较LPS组低,较正常组高.脓毒血症组小鼠血清中TNF-a的含量显著高于对照组[(180.17±39.14)pg/mL比(24.88±5.82)pg/mL,P<0.01];低剂量P12组、中剂量P12组和高剂量P12组血清中TNF-a的含量分别为(112.69±19.78)、(86.34±9.25)和(70.48±8.48)pg/mL,均明显低于脓毒血症组(均P<0.05).结论 脂多糖结合蛋白抑制肽通过抑制由TLR4和CD14介导的LPS跨膜信号转导,降LSP诱导的TNFa的释放,提高了脓毒血症小鼠的生存率.表明脂多糖结合蛋白抑制肽对急性肺损伤或脓毒血症可能具有潜在的预防和早期治疗作用.     

反义肽核酸阻抑线粒体基因表达诱导肺癌SPC细胞凋亡的实验研究

目的:探讨以反义肽核酸(Anti-sense peptide nucleic acid,asPNA)封闭肺癌SPC-A1细胞线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)转录启动子后,对其生物学特性的影响.方法:合成针对mtDNA重链转录启动子区的asPNA,构建asPNA-三苯磷复合物并鉴定,以该复合物转染人肺腺癌SPC-A1细胞系.激光共聚焦显微镜确定该复合物的亚细胞定位,RT-PCR检测转染48h后对mtDNA编码基因转录的影响,流式细胞术评估细胞周期分布及凋亡/坏死情况,自发光荧光仪检测细胞内ATP浓度,以未转染asPNA-三苯磷复合物的肺腺癌SPC-A1细胞为对照.结果:成功获得asPNA-三苯磷复合物,激光共聚焦显微镜显示该复合物顺利进入SPC-A1细胞线粒体;同未转染组相比,转染组SPC-A1细胞mtDNA编码基因的转录水平有所下降,而细胞内ATP浓度明显降低(P＜0.01);同时,细胞周期分析显示,转染组出现明显的亚二倍体峰,而Annexin V-PI双标结果进一步证实,转染组肺癌细胞凋亡率明显增加.结论:asPNA在电子移位亲脂性阳离子-三苯磷的运载下,能够进入SPC-A1细胞线粒体并阻抑其mtDNA编码基因的转录,进而影响肺癌细胞的能量合成并诱导其凋亡.     

RNA干扰her2／neu基因表达抑制肺癌A549细胞增殖的研究

目的:HER2/neu表达对肺癌细胞生物学的影响尚不明了,文中运用RNA干扰技术抑制HER2/neu表达,并观察对肺癌A549 细胞体外增殖的影响.方法:构建针对her2/neu基因的RNA干扰真核表达载体,运用脂质体介导转染A549 细胞并用G418筛选出阳性克隆株;半定量RT-PCR和Western检测转染后HER2/neu mRNA及蛋白的表达水平;FCM检测细胞周期分布; MTT法绘制细胞生长曲线观察体外细胞的增值能力.结果:成功构建针对her2/neu基因的RNA干扰真核表达载体(命名为psilence 3.1-HER2),转染后使A549 细胞HER2/neu mRNA和蛋白的表达较未转染组和阴性对照质粒转染组均显著下调;细胞G0/G1期细胞增加,S期细胞减少;细胞生长曲线右移、增殖速度明显减慢.结论:psilence 3.1-HER2能够稳定、高效、特异地抑制肺癌A549内her2/neu基因的表达,可显著抑制细胞增殖.针对her2/neu基因的RNAi策略有望成为肺癌的基因治疗的新选择.     

Wy14643对急性肺损伤大鼠肺组织抗炎作用的实验研究

目的探讨Wy14643对急性肺损伤（Acutelung injury,ALI）大鼠肺组织的保护作用及其可能机制。方法将128只雄性Wistar大鼠随机等分为对照组、致伤组、Lw 1 mg组、LW 3 mg组。用LPS（5me／kg）静脉注射复制大鼠Au模型,在静脉注射LPS 15 min后再次静脉注射Wy146431mg／kg和3mg／kg,分别在LPS后1、2、4及8h时活杀大鼠,分别采用酶联免疫吸附分析法及分光光度计法检测用药前、后各时相点大鼠肺组织匀浆及血浆中TNF—α、IL-10浓度及MPO活性。结果LW 1 mg组在2、4及8h,LW 3 mg组在1、2、4及8h血浆及肺组织匀浆上清中的TNF—α、IL-10分别较Au组相应时相点显著下降与升高（P〈0．05）;LW 1 mg组在4及8h,LW3mg组在2、4及8h肺组织匀浆上清中的MPO活性均较ALI组相应时相点显著下降（P〈0．05）。结论Wy14643对Au大鼠肺组织具有-定的保护作用,其机制可能是PPARa激活后抑制了TNF-α的释放,增加IL-10的释放,减轻肺部及全身的炎症反应。     

鞭毛蛋白在实验性脓毒症性肺损伤中作用的初步探讨

目的 在脓毒症急性肺损伤(ALI)大鼠模型中观察鞭毛蛋白在其体内可能的致炎症肺损伤作用,及其抗血清可能的对抗炎症损伤的作用.方法 复制脓毒症大鼠模型(致伤组),用鞭毛蛋白抗血清对抗(治疗组),并设定对照组(除不结扎、不刺破、不切除盲肠外,其余处理同致伤组),于2、4、6、12、24、48h时,对比观察其动脉血氧分压(PaO2)、湿/干比值(W/D)、血清和肺泡灌洗液(BALF)中鞭毛蛋白和TNF-α含量的变化以及肺组织病理改变.结果 与对照组比较:在12、24、48h时,致伤组PaO2显著降低,而W/D显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);在6、12、24、48h时,致伤组鞭毛蛋白含量显著升高;在24、48h时,治疗组PaO2显著降低,差异有统计学意义(P<0.01),而W/D显著升高(P<0.01).在12、24、48h时,致伤组TNF-α含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);在24、48h时,治疗组TNF-α含量显著升高,差异有统计学意义(P<0.01).致伤组与治疗组比较:在12、24h时,致伤组PaO2显著低于治疗组,差异有统计学意义(P<0.01),而W/D和TNF-α含量显著高于治疗组,差异有统计学意义(P<0.01).镜下观察大鼠肺组织发现致伤组在12h后发生显著的病理变化,而治疗组在24h后才发生显著的病理变化.结论 鞭毛蛋白是脓毒症时导致大鼠肺炎症损伤的重要致伤因素.     

人源性exCAR原核表达蛋白体外阻断腺病毒感染实验研究

目的 在培养乳鼠心肌细胞上检测人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区(exCAR)大肠杆菌原核表达蛋白阻断腺病毒感染的活性.方法 纯化人源性exCAR表达蛋白并通过透析复性,进一步体外实验,在腺病毒感染乳鼠心肌细胞模型上检测表达蛋白阻断腺病毒感染效率.结果 获得纯化表达蛋白exCAR,经复性后,在体外实验中检测到其阻断腺病毒感染心肌细胞效应,其终浓度为500ng/mL时,获得最高阻断效率约75%.结论 本研究获得了具有生物活性的exCAR表达蛋白,为腺病毒感染防治提供了新的思路和基础.     

人源性exCAR蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

目的 在大肠杆菌中表达人源性柯萨奇病毒-腺病毒受体胞外区蛋白(exCAR),纯化表达蛋白并进行Western-blotting鉴定.方法 从Hela细胞株中扩增exCAR基因片段,连接至表达质粒pET-28a(+)构建为重组质粒pET-28a-exCAR,转化至大肠杆菌BL21株中,筛选高表达株,诱导表达,利用Ni+株亲和纯化表达蛋白,SDS-PAGE后,转印PVDF膜后,进行Western-blotting鉴定.结果 获得纯化的大肠杆菌表达蛋白exCAR,表达形式为包涵体,经Western-blotting鉴定为人源性exCAR蛋白.结论 本研究获得了纯化的exCAR表达蛋白,为下一步的蛋白复性和腺病毒感染的阻断实验提供了基础.