构建真核表达质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3及其在脐血CD34^＋细胞中的表达

目的：构建真核表达的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3配体,为研究Flt3配体对急性放射复合伤造血功能恢复作用提供实验物质基础.方法：实验于2003-05/09在第三军医大学劳动卫生教研室完成.先用SalⅠ和BglⅡ双酶切pUMVC3-hFLT3配体,得到全长的人FLT3配体序列（0.8kb）,两端抹平后克隆至pIRES2-EGFP载体的BglⅡ位点.然后用NheⅠ和XhoⅠ酶切鉴定;最后用脂质体转染的方法将重组质粒转入脐血CD34^＋细胞中,经过G418筛选,在荧光显微镜下观察其表达.结果：①构建了双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-FLT3.②重组质粒pIRES2-EGFP-FLT3能在脐血CD34^＋细胞中的表达,凝胶电泳和测序结果证明将FLT3 cDNA亚克隆入pIRES2-EGFP内,荧光显微镜下可见脐血CD34^＋细胞胞体发出绿色荧光.③转染效率为10.3%.结论：①携带标记基因的双顺反子质粒载体pIRES2-EGFP-FLT3能稳定地转入真核细胞表达载体.②该质粒转染到分离纯化的脐血CD34^＋细胞中,并获得阳性转染细胞的克隆.