肌肉组织工程的基础研究-肌肉冻伤模型的建立

目的 为研究卫星细胞在表情肌修复中的作用,需要建立动物模型.本实验通过冷冻的原理建立肌肉冻伤模型,并研究该模型在肌肉组织工程研究中的可行性.方法 取18只8周龄C57小鼠随机分6组,采用液氮冷冻头冷冻腓肠肌的中下部分,每次40s,通过2个冻融周期,建立C57小鼠腓肠肌的冻伤模型.分别于3天,1、2、4、6、8周取材,通过采用苏木精-伊红染色观察骨骼肌受冻伤后肌组织病理变化,研究肌肉在冻伤下的自我修复能力和冻伤后组织学变化,确定植入卫星细胞的最佳时机.结果 实验证实冷冻条件下可以造成肌肉的完全性损坏,4周后肌肉的原有结构完全消失,8周后表现为均质的变性,没有再生现象.2-4周是移植细胞的最佳时机.结论 冻伤后骨骼肌内未发生白体的修复,并且保留了肌肉原有的肌膜样结构.有利于研究植入卫星细胞的生物学活性,可以作为肌肉细胞移植的模型.     

大鼠牙髓干细胞的基本细胞学特征以及增殖和矿化能力：分化为牙本质样细胞的可能性

目的：实验观察大鼠牙髓干细胞的基本细胞学特征和增殖及矿化特性。方法：实验于2003-07／10在军事医学科学院组织工程研究中心实验室完成。采用光学显微镜观察大鼠牙髓干细胞生长变化。①细胞爬片固定后用苏木精-伊红染色观察细胞的基本形态，②采用四甲基偶氮唑盐法对大鼠牙髓干细胞和骨髓间充质干细胞的生长及增殖能力进行检测比较。③应用矿化液对大鼠牙髓干细胞进行诱导并采用Von Kossa染色的方法检测大鼠牙髓干细胞矿化能力。结果：①大鼠牙髓干细胞基本形态特征：为成纤维细胞样生长。细胞呈梭形，密集区细胞形态多样，可见多角形或椭圆形细胞密集排列。②细胞生长曲线及群体倍增时间：大鼠牙髓干细胞群体倍增时间为：58．3h；骨髓间充质干细胞的生长较牙髓干细胞旺盛，其群体倍增时间为：41．8h。③大鼠牙髓干细胞矿化能力：Von Kossa染色可见细胞密集区为黑褐色，呈结节状分布，表明有钙化结节形成。结论：大鼠牙髓干细胞形态正常，虽比骨髓间充质干细胞稍弱，但仍具有较强的增殖性能，还有一定的矿化能力，说明在一定条件下可向牙本质样细胞分化。     

利用骨髓间充质干细胞膜片原位构建“三明治”样组织工程牙周膜的实验研究

目的：探讨骨髓间充质干细胞（ BMSC）膜片与胶原膜构建的“三明治”样结构植入体内后牙周膜的再生情况。方法制备BMSC细胞膜片,与胶原膜构建夹层结构复合于牙根表面,植入原位生长,分别于4和12周取材,利用X片、HE和天狼星红染色观察牙周膜的再生情况。结果相比单纯胶原膜组和空白对照组,实验组在牙根与牙槽骨间形成了清晰的软组织间隙,且有类Sharpey纤维存在,即形成了功能性牙周膜。结论细胞膜片－胶原膜－细胞膜片的“三明治”样夹层结构可较好地促进牙周膜再生。     

PAA-CS超吸水海绵应用于喂服华法林大鼠拔牙创模型的止血效果

 目的 探讨PAA-CS超吸水海绵应用于口腔拔牙创的优势。方法 建立对照组(A组)SD大鼠拔牙创模型和华法林组(B组)SD大鼠凝血功能异常拔牙创模型,以纱布棉球做阴性对照对拔牙创进行止血,比较PAA-CS超吸水海绵与纱布棉球的止血效果。结果 B组凝血酶原时间(s)较A组显著延长[(19.73±2.74)vs(10.04±0.95),P<0.05],INR值增大(3.49 vs 1)。A、B两组中,PAA-CS超吸水海绵止血时间均少于纱布棉球,差异有统计学意义(P<0.05);A组止血后无继发出血;B组应用纱布棉球止血后有4只继发出血。结论 成功建立了因喂服华法林而导致凝血功能异常的大鼠拔牙创模型,PAA-CS超吸水海绵的止血效果明显优于纱布棉球。     

以BMSCs为基础构建组织工程骨修复种植区骨量不足的实验研究

 目的 评价以骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)为基础构建组织工程骨修复种植体周围骨缺损的成骨效果。方法 在3只犬双侧下颌前磨牙区各植入2颗种植体,分为对照组和实验组,每组6颗种值体;在种植体远中制备骨缺损,对照组每侧骨缺损区随机植入富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)和实验组成骨诱导培养BMSCs复合PRP。分别于移植后1、3个月取材,行大体、影像学及组织学观察。结果 1个月后,实验组可见较多的骨基质,较少的胶原纤维。实验组骨密度值大于对照组(101±8.99)vs(93±9.81),差异有统计学意义(P<0.05)。3个月后,实验组可见较多的哈弗系统,实验组与对照组骨密度值变化不大(100.75±12.05)vs(105±11.58),差异无统计学意义。结论 以BMSCs为基础的组织工程骨能在种植体周围较好地成骨。     

人牙髓细胞DPDP-2基因的克隆、测序及序列分析

目的:在人牙髓细胞中克隆DPDP-2基因,研究其可能的功能.方法:体外培养HDPC和人牙龈成纤维细胞(HGF),应用基于PCR的改良消减杂交技术构建HDPC和HGF cDNA消减文库,批量克隆HDPC和HGF的差异表达基因并测序,使用GenBank的BLAST对测序结果进行同源序列比较,并运用计算机软件PC/GENE 6.60版对筛选到的DPDP-2基因进行结构和功能分析.结果:DPDP-2基因序列全长810 bp,没有一个完整的编码区. 可与KIAA0265 gene拼接成一个长6172 bp的完整序列,编码一个含有83个氨基酸的疏水性蛋白,其二级结构由螺旋结构、卷曲结构和伸展部分所组成. 它们可以通过α,β或α/β折叠而形成三级结构. 抗原表位分析发现它可能有3种抗原决定簇结构,即Glu-Asn-Lys-Arg-Thr-Gly,Leu-Ile-Glu-Arg-Leu-Lys和Glu-Leu-Ala-Trp-Glu-Lys. 该蛋白存在一种跨膜螺旋结构和线粒体运输肽结构. 进一步的分泌信号分析结果也证实它是一种非分泌蛋白. 经BLAST同源蛋白质搜索,在Non-redundant SwissProt sequences和PDB protein database中均未查询到同源蛋白质.结论:DPDP-2所编码的蛋白是一种跨膜蛋白,具有信号转导分子的结构特征,又具有CKⅡ的磷酸化位点,可能与细胞分裂、转录调节过程有关.     

构建含人脑源性神经营养因子基因的逆转录表达载体及其在成纤维细胞中的表达

目的 构建含有人脑源性神经营养因子(human brain-derived neurotrophic factor,hBDNF)的逆转录病毒载体pLXSN(hBDNF-pLXSN),鉴定hBDNF生物活性.方法 提取自愿捐献5月龄胎儿脑组织基因组mRNA,应用RT-PCR技术获得hBDNF基因序列,体外构建hBDNF-pLXSN感染的成纤维细胞NIH/3T3.对其进行病毒滴度检测,采用免疫组织化学染色鉴定NIH/3T3细胞中hBDNF的表达.通过对PC12细胞和大鼠背根神经节的培养,分析hBDNF生物学活性.结果 测序结果表明成功构建了hBDNF-pLXSN.被感染的NIH/3T3细胞免疫组织化学染色显示胞浆中有hBDNF表达.hBDNF-pLXSN具有促进PC12细胞增殖的作用,并可以使培养的背根神经节长出神经突.结论 hBDNF-pLXSN病毒可以感染NIH/3T3细胞并使其表达和分泌具有生物学活性的hBDNF,可以作为面瘫基因治疗研究的工具.