PCR产物液相杂交检测的优化

目的 为了使液相杂交检测更加灵敏、特异、快速。方法 通过改进杂交液的成分,选择最佳的探针浓度,使5＇端标记生物素的PCR扩增产物与5＇端标记地高辛的探针在PCR反应管中进行液相杂交,杂交条件为:94℃ 10 s冷却到37℃ 10 s即完成杂交。杂交后产物通过链霉亲和素被固定在微孔表面,同时在含高浓度DMSO的杂交液中将非特异结合的探针解离,然后对被固定的特异杂交产物进行ELISA检测。结果 液相杂交的条件优化:杂交液中二甲基亚砜(DMSO)浓度为300 ml·L~(-1),探针浓度为0.5μmol·L~(-1),杂交温度为37℃。对60～600 bp的PCR产物的杂交特异性无明显差异,可以检测到1×10~4copy的PCR产物,对100例乙型肝炎患者的血清进行检测,HBsAg(+)、HBeAg(+)、抗HBc(+)的血清检出HBV DNA阳性率为100％(30/30);HBsAg(+)、抗HBe(+)、抗HBe(+)的血清检出HBVDNA阳性率为78.6％(22/28);HBsAg(+)、抗HBe(+)的血清检出HBV DNA阳性率为66.7％(16/24),其余为阴性。结论 该液相杂交法操作简单、快速、灵敏、特异,适合临床实验室使用。     

加强输血管理 保证用血安全

目的通过对输血流程的质量管理,实现临床输血的零差错、零事故,保证临床用血安全。方法根据《江苏省医疗机构输血科（血库）建设管理规范》的要求,建立和健全临床输血的管理制度和操作规程,加强临床输血的组织管理、科室建设和质量管理,注重输血流程的环节管理,规范操作、强化考核,充分发挥各环节在输血工作中的作用,切实把好输血环节质量关。结果经过严格管理和持续改进,我院二十多年来临床输血无差错、无事故。结论输血工作环节多,涉及面广,过程复杂,所有环节中都可能隐含着人为因素的错误,从而影响输血工作的质量和安全。临床输血管理是保证临床输血安全的关键,因此必须加强教育和培训,使每位从事临床输血的工作人员深刻认识到输血工作的重要性,强化＂输血无小事＂的理念,以踏实的工作作风、认真的工作态度、严谨的工作精神,切实做好输血流程中的各项操作,确保临床输血的质量和安全。     

HBV DNA C区BCP双突变PCR-FP检测方法的建立及其临床应用

目的 :建立简便的 HBV DNA序列中 BCP双突变的检测方法。方法 :采用终点终止法和偏振光检测技术进行点突变的检测。首先对 HBVC区基因进行 PCR扩增 ,然后用特异探针与扩增产物中待测核苷酸的下游序列杂交 ,使探针的 3’端可以在 DNA聚合酶的催化下 ,依据其互补链上的待测核苷酸连接上一个标有特定荧光素的 d NTP,然后检测该3’端带有荧光素的探针 ,根据检测到的荧光素种类和偏振光的强度可以判定待测点是何种核苷酸。结果 :该方法可以检测出 HBV基因序列中 BCP双突变核苷酸类型 ,可以检测 1个拷贝的模板 ,并且可以从 BCP野生型株 DNA序列中检出 5 % BCP双突变 DNA序列 ,对 76例 HBV DNA阳性患者进行检测 ,结果 HBV BCP基因双突变率为 5 3.9( 4 1 /76)。结论 :该技术可以对血清中 HBV DNA C区 BCP双突变。     

焦磷酸测序检测RARβ2基因启动子甲基化方法的建立

目的：建立基因启动子甲基化的焦磷酸测序检测方法,为基因启动子甲基化标志物的检测奠定基础。方法：从正常人全血中提取基因组DNA。采用复合巢式PCR的方法扩增目的基因,克隆构建对照标准品质粒。使用甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2基因启动子CpG岛的5个甲基化位点,双脱氧测序验证。将阳性和阴性对照标准品质粒PCR扩增产物按不同比例混合后进行焦磷酸测序,检测每个点的甲基化程度,制作校正曲线。结果：构建了甲基化特异性焦磷酸测序阴性对照和阳性对照标准品。经焦磷酸测序检测后,阴性对照标准品甲基化程度为0％,阳性对照标准品甲基化程度为100％,与双脱氧测序结果一致。经对混合样品检测,甲基化频率符合线性关系,线性相关性大于0.99,斜率约为1,并且所有位点的标准偏差约为1％。结论：成功构建了甲基化特异性焦磷酸测序检测RARβ2启动子区域甲基化阳性对照和阴性对照标准品质粒。建立了甲基化特异性焦磷酸测序检测基因启动子甲基化的方法。     

胶体金免疫斑点法检测人巨细胞病毒pp150抗体

目的：建立一种简便、快速的检测血清中人巨细胞病毒（HCMV）抗pp150抗体的胶体金免疫斑点法。方法：采用Frens法制备胶体金颗粒,标记葡萄球菌A蛋白（SPA）,将本所利用基因工程技术生产的pp150抗原固定于0．45μm孔径的硝酸纤维素膜上,制成免疫斑点检测装置。血清中抗pp150 IgG与硝酸纤维素膜上的抗原结合,然后滴加胶体金标记的SPA,在膜上可形成肉眼可见的红色斑点。结果：胶体金免疫斑点法与ELISA试剂盒对比检测了200份临床确诊血清标本中抗pp150 IgG抗体,胶体金法的特异性和敏感性分别为92％和90％。结论：胶体金免疫斑点法检测血清中的抗pp150抗体特异性、灵敏度较高,简便快速,不需要昂贵的仪器。     

急性大出血患者输注冷沉淀的疗效观察及护理

目的：探讨IC U急性大出血患者输注冷沉淀的临床疗效及护理。方法回顾性调查本市某医院2013年ICU收治的急性大出血患者69例,观察冷沉淀输注前、后3 d内最近1次的凝血酶原时间（PT ）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原（Fg）、抗凝血酶Ⅲ（ATⅢ）变化。结果与输注前相比,PT、TT明显缩短,Fg、ATⅢ含量增加,APTT无明显变化。输注前PT（18．63 ± 8．91）s、TT（24．2±10．08）s、Fg（1．57 ± 1．93） g／L、ATⅢ（53．84±26．72）％和输注后PT（15．03 ± 4．48）s、TT（20．31 ± 5．60）s、Fg（2．31 ± 1．34）g／L、ATⅢ（66．19±21．70）％（均为 P＜0．05）;输注前APTT（49．51±25．24）s和输注后APTT（44．93±19．63）s差异无统计学意义（P＞0．05）。结论 ICU急性大出血患者抢救时经科学、合理、有效的输注冷沉淀,提供相应的护理,可改善患者的凝血功能,取得较好的止血效果,提高患者生存率。     

胃癌及癌前病变粘膜中呈高表达6个基因片段的筛选及其临床意义

目的　筛选数个在胃癌及癌前病变粘膜中检出率高的差异表达基因片段并探讨其临床意义．方法　以筛选出的ｇｃｙｓ１ 至ｇｃｙｓ１８ 的新基因片段作为研究对象,采用定量ＲＴＰＣＲ 技术检测４８ 例胃癌、１６ 例其他肿瘤及１１０ 例活检的胃粘膜标本．结果　①在４８ 例胃癌中,表达检出率高的６ 个片段依次为：ｇｃｙｓ１０ 为９０－５ ％ ,ｇｃｙｓ１ 为８０－９ ％ ,ｇｃｙｓ１８ 为６９－５ ％ ,ｇｃｙｓ１１为６１－９ ％ ,ｇｃｙｓ４ 为４２－８ ％ ,ｇｃｙｓ８ 为３５－７ ％ ,在癌旁组织中检出率＜ １０ ％ ;６ 个片段的检出率在胃癌及癌旁组织中存在显著性差异（ Ｐ ＜ ０－０１） ;②在１６ 例其他肿瘤中, 表达率依次为：ｇｃｙｓ１０ 为３７－５ ％ ,ｇｃｙｓ１ 为１４－３ ％ ,ｇｃｙｓ１８ 为２７－５ ％ ,ｇｃｙｓ１１为４３－７ ％ ,ｇｃｙｓ４ 为１４－３ ％ ,ｇｃｙｓ８ 为３１－３ ％ ;③３３ 例萎缩性胃炎中,表达率依次为：ｇｃｙｓ１０ 是４０－５ ％ ,ｇｃｙｓ１ 是１６－７ ％ ,ｇｃｙｓ１８ 为４４－５ ％ ,ｇｃｙｓ１１ 为４３－３ ％ ,ｇｃｙｓ４ 为３３－３ ％ ,ｇｃｙｓ８为４８－３ ％ ;２８ 例肠腺化生     

用分级定量RT-PCR测定中国人血清中HCV RNA

基因的定量分析对分子生物的研究有着重要的作用,而采用ＰＣＲ方法进行基因定量已成为一种有效的方式．并且,目前已有多种利用ＰＣＲ进行基因定量的方法,其中以竞争ＰＣＲ定量和ＰＥ公司既时定量ＰＣＲ方法测定结果较为准确,应用较多既时定量ＰＣＲ方法采用了特殊设计的荧光－淬灭探针和精密的既时荧光检测设备进行定量．该方法简化的操作,提高的测定的灵敏性和准确性,但其试剂和仪器的价值目前相当昂贵,一般实验室难于承担［１］．而竞争ＰＣＲ方法虽然操作比较麻烦,但也能进行较准确的定量,适合一般实验室使用,为了进一步简化竞…     

A rapid and sensitive method to detect mycobacterium tuberculosis DNA by fluorescence polarization

Objective: To develop a new high sensitivity, rapid and simple mycobacterium tuberculosis DNA detection method using fluorescence polarization technology. Methods: In our asymmetric PCR protocol, 100 times mole of TB-R primer was added than in the usual symmetric PCR to get enough single strands PCR product. The probe TB-5‘-TAMRA and PCR products were mixed in a tube and incubate for 5 - 15 min at 46℃.The polarization (mp) was measured using victor2 Multilabel Plate Reader. Results: Asymmetric and symmetric PCR products were analyzed by the FP method. Asymmetric PCR products are detected more sensitively than symmetric ones. The polarization values of probe associated with asymmetric products were much higher than with symmetric products. Conclusion: This fluorescence polarization assay in conjunction with asymmetric PCR is a powerful and widely applicable method for the rapid and sensitive detection of micro-organisms in clinical laboratories.     

解脲支原体Ⅰ型MB抗原主蛋白氮端基因的克隆及原核表达

目的 从新鲜培养的解脲支原体（URA）I型培养液获得其MB抗原主蛋白N端1／3保守区的基因，并体外表达，获得具有抗原活性的原核表达蛋白，为研制广谱、低廉及方便准确的URA感染的诊断及治疗方法提供物质基础。方法 从新鲜培养的URA标准株I型培养液提取DNA模板，采用特异引物及聚合酶链方法获得其MB抗原主蛋白N端1／3保守区的基因，经克隆入测序载体验证DNA大小及序列后，将MB抗原主蛋白N端1／3保守区的基因克隆入高效原核表达载体，并在大肠杆菌中表达，初步以Western-blot测定表达产物的抗原性即与感染者阳性血清的反应活性。结果 以笔者设计的特异引物，能得到预期大小的PCR产物，并能插入预定的克隆载体中测序，所得基因的序列符合目的基因的序列，其插入原核表达载体能获得表达，且表达产物具有抗原活性，能与感染患者的血清发生抗原抗体反应。结论 所得到的MB抗原主蛋白N端1／3保守区片段的基因，与GENE BANK检索序列一致。在大肠杆菌中表达此片段所获得的表达产物，有抗原活性，有望用于URA抗体检测及疫苗研制。