构建原代分离培养与鉴定小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的方法及模型

背景：肺泡Ⅱ型上皮细胞在肺发育和肺功能调节中起重要作用,它与肺纤维化和肺癌等疾病的发生发展有密切联系,为了对这些疾病进行体外实验研究,必须对肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、原代培养与鉴定以建立一个稳定高效的细胞模型。 目的：建立一套可靠的小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、纯化、原代培养与鉴定的方法,为肺纤维化及肺癌等疾病的进一步研究奠定基础。 方法：①用低浓度胰酶联合Ⅰ型胶原酶消化法,分离小鼠肺组织细胞成分。取出小鼠肺组织,剪成小块,加入胰蛋白酶,移出细胞悬液,加入含胎牛血清的DMEM中止消化;同法用胰蛋白酶再消化1次,中止消化后加入Ⅰ型胶原酶,再中止消化。②经差速离心差速贴壁和免疫黏附法纯化肺泡Ⅱ型上皮细胞,进行原代培养。将肺细胞悬液接种入包被小鼠IgG的培养皿中培养,吸出含未黏附细胞的液体接种于另一包被小鼠IgG的培养皿中培养,吸出未黏附细胞,去上清,重悬沉淀,将细胞接种于培养皿和培养板中培养。倒置显微镜观察细胞形态及生长特点,测定肺泡Ⅱ型上皮细胞产量、纯度及活力,免疫细胞化学染色鉴定肺泡表面活性蛋白A和肺泡表面活性蛋白C的表达,透射电镜鉴定肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性细胞结构。 结果与结论：用此方法,每只小鼠获得肺泡Ⅱ型上皮细胞(4.8±1.2)×106,纯度达到(85.0±2.4)%,细胞活力为(92.0±2.4)%,倒置显微镜下原代肺泡Ⅱ型上皮细胞呈圆形或立方形,细胞质内有大量反差明显的细小颗粒,细胞为岛状生长方式;免疫细胞化学鉴定,肺泡表面活性蛋白A呈棕黄色,肺泡表面活性蛋白C呈绿色,均定位表达于细胞浆;透射电镜见特征性板层小体和细胞游离面大量微绒毛。证实利用胰酶联合胶原酶消化,差速离心差速贴壁和免疫黏附纯化的方法可获得高产量高纯度的AECⅡ,能满足一般的体外实验要求。     

白细胞介素32在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化组织中的表达及意义

目的 探讨白细胞介素32(IL-32)在博来霉素(BLM)诱导的小鼠肺纤维化过程中各期的表达和意义.方法 将72只雄性小鼠随机分为三组,每组24只.分别给予0.9%氯化钠注射液0.04 ml(C组)和等量的BLM(5 mg/kg)(B、A组),一次性气管内灌注.A组在BLM灌注后每天给予地塞米松5 mg/kg腹腔注射.然后各组分别于第3、7、14和28天各处死6只小鼠,取肺组织,做病理切片、免疫组织化学染色,应用Western blot法测定IL-32表达.结果 B组肺组织病理切片按时间顺序呈现由肺泡炎至纤维化动态改变.B组肺组织中IL-32蛋白表达水平高于C组(P＜0.01)和A组.结论 IL-32在肺纤维化形成过程中高表达,可能在肺纤维化形成的早中期发挥重要作用.     

丹参酮ⅡA磺酸钠抑制低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及其机制

目的: 观察丹参酮ⅡA磺酸钠(sodium tanshinone ⅡA sulfonate,STS)对低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMC)增殖的影响及其潜在的作用机制。方法: 将大鼠PASMC分为常氧组、常氧+STS组(5、10、20 ng/mL)、低氧组(3%O2)、低氧+STS组(5、10、20 ng/mL),培养60 h后,采用CCK-8法测定PASMC的增殖率;另将大鼠PASMC分为常氧组、低氧组、低氧+STS组(10 ng/mL),qRT-PCR测定mTOR、eIF2α、c-myc mRNA的相对表达量;再将PASMC分为常氧组、低氧组、低氧+STS组(10 ng/mL)、低氧+雷帕霉素组(20 nmol/L),蛋白质印迹法检测mTOR、p-mTOR、eIF2α、p-eIF2α、c myc蛋白的表达量。结果： 与常氧组比较,低氧组细胞增殖率明显升高(P＜0.05);与低氧组比较,低氧+STS组细胞增殖率明显降低(P＜0.05)。qRT-PCR显示低氧组mTOR、eIF2α和c-myc mRNA相对表达量较常氧组明显升高(P均＜0.05),低氧+STS组3种mRNA相对表达量较低氧组降低(P均＜0.05)。蛋白质印迹显示,与常氧组比较,低氧组mTOR、p-mTOR、eIF2α、p-eIF2α、c-myc蛋白表达均显著升高(P均＜0.05);与低氧组比较,低氧+STS组和低氧+雷帕霉素组的mTOR、p-mTOR、eIF2α、p-eIF2α、c-myc蛋白表达均升高(P均＜0.05);而低氧+雷帕霉素组与低氧+STS组无明显差异(P＞0.05)。 结论： STS可抑制低氧诱导的大鼠PASMC增殖,可能通过抑制mTOR/eIF2α信号通路而发挥作用。     

白细胞介素13基因启动子区多态性与特发性肺纤维化的关系

目的 探讨白细胞介素13(IL-13)基因启动子区-1112(C/T)位点基因多态性与特发性肺纤维化(IPF)的相关性. 方法 研究组IPF患者70例,根据肺功能分为3个亚组,以A(弥散功能轻度下降,22例)、B(弥散功能中度下降,20例)、C(弥散功能重度下降,28例)组表示,80例健康体检者作为对照组.外周血提取基因组DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测IL-13基因启动子区-1112(C/T)位点的基因多态性. 结果 研究组IL-13基因启动子区-1112(C/T)位点的基因多态性分布为CC纯合子28例(40.0%),TT纯合子6例(8.6%),CT杂合子36例(51.4%);对照组CC纯合子30例(37.5%),TT纯合子11例(13.8%),CT杂合子39例(48.8%),-1112(C/T)位点等位基因C、T在两组间分布及三种基因型之间构成比比较差异无统计学意义(P＞0.05).A组CT和TT基因型共9例(40.9%),B组CT和TT基因型共10例(50.0%),C组CT和TT基因型共23例(82.1%),三组间比较差异有统计学意义(P均＜0.05). 结论 IL-13基因启动子区-1112(C/T)位点基因多态性与IPF的发病无关,但与其肺弥散功能的损害程度有关.     

弥漫浸润的肺部肿瘤：附43例分析

木文报告了43例弥漫浸润的肺部肿瘤,并讨论了这组疾病的临床特点、诊断与治疗措施.指出:(1)加强健康体检,可以尽早地发现无症状的肺部肿瘤;(2)经纤维支气管镜肺活检(TBLB)对弥漫浸润的肺肿瘤有重要诊断价值;(3)对原有弥漫性间质性疾病的患者,要积极随访,必要时重复 TBLB检查,及早发现恶变.     

ECM支架构建肺成纤维细胞三维培养模型研究

应用组织工程技术建立新型稳定、可靠的肺成纤维细胞（LF）三维培养模型的方法。应用细胞外基质（ECM）支架为成纤维细胞培养载体,建立成纤维细胞三维培养体系;并同时分别加入IL-13单克隆抗体、TGF-β及LPS。应用细胞荧光免疫、细胞计数及扫描电镜观察肺成纤维细胞三维培养的生长特性及相关物质对细胞生长状况的影响。在此三维培养模型中,细胞、细胞外基质以及IL-13单克隆抗体、TGF-β等调控因素共同构成一个有机整体,成纤维细胞所表达的生物学特性接近于它们在体内肺组织中的特点。本实验应用组织工程技术成功地建立了新型肺成纤维细胞三维培养体系,并研究成纤维细胞的生物学特性,是研究间质性肺病（ILD）领域里一个新的和更为科学的方法。     

间质性肺病支气管肺泡灌洗液中TNF和IL—2的临床研究

同步检测了３０例间质肺病（ＩＬＤ）患者和９例正常对照者的支气管肺泡灌洗液（ＢＡＬＦ）中肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）和白细胞介素－Ⅱ（ＬＩ－２）含量，并探讨其意义，结果显示ＩＬＤ病人ＢＡＬＦ中ＴＮＦ含量明显高于正常对照者（Ｐ〈０．０５），ＢＡＬＦ中ＩＬ－２测定值亦以ＩＬＤ病人显著增高（Ｐ〈０．０５或Ｐ〈０．０１），且与结节病缚ＢＡＬＦ淋巴细胞百分化，ＣＤ４／ＣＤ８比值之间有高度相关性。作者认为，ＢＡＬＦ中     

中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂研究现状

中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)与许多疾病,尤其是急性肺损伤(ALI)的发生、发展有关。人体内存在四种内源性中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(NEI)α1Pi、SLPI、elafin、α2-MG,但它们分子量较大,对氧自由基敏感,因而难以渗透到炎症区域发挥作用。人工合成NEI(西维来西钠)分子量小,对氧自由基不敏感,在治疗不同急性肺损伤实验动物模型及大规模临床研究的结果表明,西维来西钠均表现出明显的保护作用,其肺泡灌洗液中性粒细胞数、蛋白浓度、NE活性明显下降,肺血管通透指数下降,肺水肿减轻,氧合指数(PaO2/FiO2)改善。NEI新药的开发及用于治疗ALI是目前研究的热点。     

IL-33参与促进A549细胞上皮-间质转化及作用机制

目的 探讨在上皮来源的A549细胞上皮-间质转化进程中,IL-33/ST2L信号传导系统的作用及其机制.方法 培养A549细胞,RT-PCR检测受体ST2L mRNA;不同浓度白细胞介素-33(IL-33)刺激细胞,在不同时间点以MTT方法检测IL-33对A549细胞增殖的影响;以Real-time PCR法检测不同时间点A549细胞标志性基因E-cad mRNA、α-SMA mRNA以及Vimentin mRNA等的变化和IL-33/ST2L信号通路中关键因子TRAF-6 mRNA的表达改变;Westem blot法检测细胞标志性蛋白E-cad、collagenI、Vimentin 以及TRAF-6的改变.结果 IL-33对A549细胞的增殖没有影响;不同浓度(5、10及50 ng/mL)IL-33刺激A549细胞24 h,E-cad的表达随浓度的升高逐渐下降、α-SMA的表达随浓度的升高逐渐上调,选择10 ng/mLIL-33作为A549细胞的刺激浓度;随着IL-33刺激时间的逐渐延长,E-cad的表达先降低后升高,α-SMA、Vimentin、collagenI以及TRAF-6的表达呈现先升高后降低的趋势.结论 IL-33/ST2L信号通路的激活能促进A549细胞间质变,尤其是在早期炎症反应阶段作用最为明显.