MHC-Ⅰ荧光四聚体载体的构建及其真核表达

目的 构建MHC-I荧光四聚体真核表达质粒,并表达、纯化该蛋白,以更简便地检测特异性T细胞.方法 运用分子克隆技术,构建sKb-ZsGreen-6 × His标签的融合蛋白真核表达质粒,转染293FT细胞表达,并以镍亲和层析法纯化.结果 经酶切及测序鉴定证实成功构建了MHC-I荧光四聚体真核表达质粒并完成表达、纯化,并经SDS-PAGE电泳证实.结论 得到了纯化的MHC-I荧光四聚体,并经流式细胞术证实其与β2-微球蛋白、OVA肽结合后能被B3Z细胞识别,为特异性T细胞检测提供了一种更方便的方法.     

小鼠肥大细胞瘤基因疫苗的免疫治疗作用研究

目的：探讨α－病毒RNA复制酶对基因疫苗的免疫学效应的加强作用，寻找更好的基因疫苗形式。方法：将小鼠肥大细胞瘤P815的肿瘤特异抗原PIA基因克隆到含SFV的RNA复制酶的真核表达载体pSMART2a中，以此作为肿瘤基因疫苗，观察该疫苗对P815种植瘤的防治作用、特异细胞毒T淋巴细胞激活和抗体的生成情况。结果：该重组基因疫苗在体外有很好的表达，注射后CTL的最大杀伤率为60%，而普通载体疫苗形式pCI-neo/PIA则只有40%的杀伤活性；在观察期限内，前者的动物成瘤率和动物生存率分别为20%和40%。后者则分别为60%和20％。两种情况下都不能检测到任何特异抗体的产生。结论：α－病毒RNA复制酶对基因疫苗的免疫学效应有加强作用。     

骨形态发生蛋白-2在大鼠脑内嘴侧迁移流中的发育学表达

目的了解骨形态发生蛋白2（BMP-2）在大鼠脑的不同发育阶段，嘴侧神经干细胞迁移流中的表达模式。方法用RT—PCR和免疫荧光染色的方法观察大鼠SVZa、RMS、OB三个区域在不同发育阶段BMP-2的表达情况。结果在不同的发育时期，大鼠脑内SVZa、RMS、OB这三个不同的区域BMP-2 mRNA都有不同程度的表达，但是显然表达量均不是很高。其时空变化趋势为：（1）在大鼠SVZa、RMS和OB三个部位，BMP-2的表达水平在胚胎14d都明显高于出生后0d和7d两个时间点，在出生7d这个时相点上，BMP-2的表达水平最低。（2）在三个时相点上，BMP-2在嗅球的表达水平都相对较高，在SVZa区的表达也较高，而在RMS表达量相对较低。结论在大鼠脑发育过程中，BMP-2在SVZa、RMS、OB三个区域的具有时空表达模式的差异性，提示BMP-2可能对SVZa神经干细胞（NSCs）的增殖、迁移和分化起重要的调控作用。     

小儿脑性瘫痪康复护理中的生活指导

介绍了脑性瘫痪患儿生活护理中的抱位姿势、卧位姿势、进食姿势、饮水姿势及进食困难的护理.     

多表位组合肽诱导HLA-A2+人PBMC产生抗原特异性CD8+ T细胞应答的研究

目的 探讨基于HBV抗原优势表位的治疗性多肽抗原组分、结构与体外诱导CD8^ T细胞应答之间的关系。方法 用计算机辅助分子设计技术，设计基于HBV抗原免疫优势性CTL表位、B细胞表位和破伤风类毒素通用Th细胞表位的3种治疗性多肽候选疫苗分子，经Merrifield固相多肽合成技术合成，并经HPLC纯化、鉴定。以HLA-A2^ 健康人和慢性乙型肝炎患者的PBMC为实验对象，进行体外诱导CD8^ T细胞应答的免疫学功能研究。结果所设计治疗性多肽分子可在体外诱导较强的抗原特异性CD8^ CTL应答；“-AAA-”铰链区设计和“Th B”细胞表位的引入可增强CTL表位肽的免疫原性。结论 提示在治疗性表位多肽疫苗的分子设计中，短而高柔性的“铰链区”设计和“Th B”细胞表位的引入可显著提高小分子表位肽的免疫原性。     

基于HBV核心抗原CTL表位的治疗性多肽在体诱导抗原特异性细胞免疫应答的研究

目的：探讨基于表位的治疗性多肽抗原组分、结构与诱导免疫应答之间的关系。方法：用分子设计的理论和方法，设计基于HBV抗原免疫优势性CTL、Th及B细胞表位的3种治疗性多肽候选疫苗分子，经Merrifield固相多肽合成技术合成，并经HPLC纯化、鉴定。以BALB/c(H-2^d)纯系小鼠为实验对象，进行体内免疫学功能研究。结果：所设计治疗性多肽分子可在体诱导较强的抗原特异性CTL应答和适度的抗体反应。Th、B细胞表位的引入可增强CTL表位肽的效应。结论：提示在治疗性表位多肽疫苗的分子设计中，引入B-、Th表位可显著提高CTL表位肽的免疫原性。     

溶酶体膜蛋白-2抗体诱导中性粒细胞胞外捕网形成的实验研究

目的研究溶酶体膜蛋白-2抗体(LAMP-2-antibody)诱导中性粒细胞胞外捕网形成(NETosis)的作用,为进一步探讨这种新型细胞死亡模式在系统性小血管炎中的作用及机制奠定基础。方法采用PolymorphprepTM进行密度梯度离心法分离健康志愿者外周静脉血中性粒细胞,抗LAMP-2抗体刺激中性粒细胞,以及通过NADPH氧化酶抑制剂二甲苯基碘(DPI)阻断活性氧簇的产生,电镜、免疫荧光观测胞外捕网的形成,激光共聚焦检测自身抗原LAMP-2、PR3、MPO的表达。结果 LAMP-2抗体促进中性粒细胞胞外捕网NETs形成,自身抗原MPO、PR3及LAMP-2包含在NETs内,抑制NADPH氧化酶的活性可以阻断NETs形成。结论 LAMP-2抗体可能通过诱导中性粒细胞异常死亡,释放内源性危险信号,激活自身免疫反应等来维持血管炎的恶性持续状态。     

治疗用HBV模拟抗原的设计及其诱导慢性乙型肝炎患者外周血CTL活性研究

目的：引入四聚体技术比较基于不同表位组合的模拟抗原分子的免疫原性，研究其结构与诱导免疫应答之间的关系。方法：以乙型肝炎病毒核心抗原(HBeAg)18～27表位为基础，分别引入了TH、TH B细胞表位，合成了3种模拟抗原，并以这3种模拟抗原在体外刺激慢性乙型肝炎患者的外周血单个核细胞为模型，通过HLA—A2 *0201 tetramer定量检测抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)。结果：3种模拟抗原分子能有效地诱导慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞产生抗原特异性CTL反应；TH和B细胞表位的引入可增强该效应。结论：我们所建立的四聚体技术可定量检测表位特异性CTL；模拟抗原的设计中引入TH、B细胞表位可增强其免疫原性。     

人microRNA-146a慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建针对has-miR-146a的慢病毒表达载体,并鉴定成熟has-miR-146a在细胞内表达水平。方法PCR扩增pri-miR-146a,克隆于慢病毒载体plenti-GFP中,转染293FT细胞,收获并浓缩慢病毒颗粒,感染Jurkat细胞。结果成功构建了has-miR-146a的慢病毒表达载体,建立了高效转染系统。结论建立了高效稳定表达has-miR-146a的慢病毒转染系统。     

TRAG-3 HLA-A2.1限制性CTL表位的预测及结合力分析

目的：寻找并鉴定TRAG-3来源的HLA-A2.1限制性CTL表位，为临床开展基于TRAG-3表位的特异性免疫治疗奠定基础。方法：应用超基序和量化基序方案预测TRAG-3HLA-A2.1限制性CTL表位；采用标准Fmoc方案合成侯选表位，RP-HPLC纯化、分析多肽，质谱鉴定各肽；最后，用T2细胞株测定各肽与HLA-A2.1分子的结合力。结果：超基序和量化基序方案预测出了4个侯选表位肽；标准Fmoc方案合成的各肽经纯化后纯度大于90％，各肽的相对分子质量与理论值一致；在4个侯选表位肽中，ILLRDAGLV(58-66)九肽与HLA-2.1的结合力最强。结论：表位预测的结果与结合力分析实验结果一致性较好，两者联合应用初步认为ILLRDAGLV(58-66)九肽为TRAG-3HLA-A2.1限制性CTL表位的可能性最大。