不同肝病患者一氧化氮合酶(NOS)表达水平及其临床意义

目的：探讨肝病患者抗氧化能力（TAO）及一氧化氮合酶（NOS）表达的临床价值。方法：收集急性肝炎（AH）,慢性肝炎（CH）,肝硬化（LC）及肝癌（HCC）患者血清,分别检测其TAO,NOS浓度及NO水平,分析它们在肝脏疾病中的改变机制。结果：患者血清TAO在AH,CH中异常率占80％,在LC和HCC为50％,血清中NOS活性在肝病患者中的异常率在70％左右;NO水平在AH,CH和LC中异常率为70％,HCC组为48％。AH组,CH组TAO平均水平明显高于对照组,但LC和HCC组的差异不明显,肝病患者NO和NOS平均浓度均非常明显高于对照组,但HCC患者NOS和NO平均浓度均低于AH,CH和LC组患者,结论：肝病患者血NOS水平与NO浓度呈高度正相关,NO增加可能对肝细胞起保护作用。     

外周血高尔基体糖蛋白-73表达水平对肝细胞癌的诊断与鉴别诊断价值

目的定量分析肝病患者血清高尔基体糖蛋白-73(GP73)水平,探讨其对肝细胞肝癌(HCC)的诊断与鉴别诊断价值。方法收集不同肝病患者外周血标本,以酶联免疫吸附法(ELISA)检测GP73浓度,并分析与甲胎蛋白(AFP)的相互关系。结果血GP73表达水平,正常对照组为(28.83±21.00)ng/ml,慢性肝炎组为(49.86±40.46)ng/ml,肝硬化组为(62.30±56.30)ng/ml,肝癌组为(66.75±69.97)ng/ml;GP73水平随着肝病的进展呈进行性增加,肝癌组明显高于对照组和慢性肝炎及肝硬化组(P<0.05)。肝癌患者血GP73表达水平在HBV感染(HBsAg阳性/阴性)、肝外转移与否组间对比,差异有统计学意义(P<0.05)。且GP73与AFP表达改变呈显著正相关(r=0.961,P=0.039),血AFP的ROC曲线下面积为0.877,GP73为0.931,GP73与AFP联合检测对肝癌有互补诊断价值。结论血GP73表达异常与肝癌发展密切相关,定量检测有助于肝癌的诊断和鉴别。     

沉默GPC-3基因质粒构建及对HepG2细胞增殖的抑制作用

目的:构建磷脂酰肌醇蛋白多糖(glypican,GPC)-3 shRNA质粒,观察GPC-3活化干扰对肝癌(HepG2)细胞的抑制作用。方法:设计与合成多条针对GPC-3序列的shRNA,插入pGPU6/GFP/Neo载体,构建、转染HepG2细胞、筛选高效质粒,观察沉默GPC-3表达对肝癌细胞增殖的抑制作用与机制。结果:经BamHⅠ或PstⅠ酶切鉴定,证实插入pGPU6/GFP/Neo载体GPC-3 shRNA序列正确,成功构建GPC-3 shRNA干扰质粒。以脂质体介导,将GPC-3shRNA1～4分别转染HepG2细胞,shRNA1沉默GPC-3 mRNA最高效率达89.3%,可有效抑制HepG2细胞增殖,在72 h达71.1%;shRNA1干扰使HepG2细胞周期阻滞在G1期,促进癌细胞发生凋亡(65.6%)。结论:shRNA可有效干预肝癌细胞GPC-3基因转录,促进凋亡并抑制增殖,GPC-3可望成为肝癌基因治疗的靶目标。     

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的表达特征及其在肝癌诊断与鉴别诊断中的价值

目的 研究磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC-3)的表达特征及其在肝癌诊断与鉴别诊断中的临床价值.方法 制作鼠肝癌模型,并按病理组织检查结果分为正常组、肝细胞变性组(变性组)、癌前病变组(癌前组)和肝细胞癌组(癌变组).以Western blot和逆转录-聚合酶链反应分别观察GPC-3蛋白质及mRNA的动态表达;以自身配对法收集术后肝癌组织,根据其组织学类型分为肝癌组、癌旁组、远癌组,以免疫组织化学法分析GPC-3表达与病理学特征的关系;以酶联免疫吸附法定量分析肝病患者外周血GPC-3表达水平,并评价其诊断效率.多个样本均数比较用单因素方差分析,组间GPC-3的表达及病理学特征比较用单因素秩和检验,血清GPC-3比较用秩和检验,率的比较采用x2检验或Fisher's exact分析,以受试者工作特征曲线下面积比较GPC-3诊断肝癌的敏感性、特异性及诊断效率.结果 在鼠肝癌形成过程中,正常、变性、癌前和癌变组GPC-3阳性率分别为0(0/6)、83.3%(15/18)、100.0%(9/9)和100.0%(9/9).人肝癌组织GPC-3阳性呈棕黄色颗粒状染色,定位于胞质和细胞膜,肝癌、癌旁和远癌组的阳性率分别为80.6%、41.7%和0,肝癌组明显高于远癌组(x2=48.56,P＜0.01)和癌旁组(x2=11.455,P＜0.01);癌旁组明显高于远癌组(x2=18.94,P＜0.01).GPC-3表达与肿瘤分化程度和数目间未见明显相关,与瘤体大小有关(Z=2.941,P＜0.01).肝病患者血清GPC-3异常主要见于肝癌(52.8%,65/123),且在不同性别、年龄、甲胎蛋白水平、肿瘤数目、Child分级和肝外转移者间未见明显差异;但肝癌＜3.0cm组明显高于≥3.0cm组(x 2=6.318,P＜0.05); HBsAg阳性组明显高于阴性组(x 2=23.362,P＜0.01).GPC-3与甲胎蛋白(＞20 μg/L)联合诊断肝癌的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值分别为87.00%、79.66%、82.17%、69.03%和92.16%.结论 GPC-3表达与肝癌密切相关,其表达的检测有助于肝癌早期诊断和鉴别诊断.

Abstract：

Objective To investigate the expression features of glypican-3 (GPC-3)and its diagnostic and differential values in hepatocellular carcinoma (HCC). Methods Rat hepatoma models were made and the dynamic expression features of GPC-3 protein and its gene were investigated by Western blotting and RT-PCR respectively. Liver specimens from 36 HCC patients were collected by self-control method and the expression and clinicopathological features of GPC-3 were analyzed by immunohistochemistry. Serum GPC-3 levels were quantitatively detected by ELISA and its efficiency for HCC diagnosis was evaluated in patients with liver diseases. Results The incidence of GPC-3 was 0% in control, 83.3% in degeneration, 100% in precanceration and 100% in canceration during dynamic formation of rat hepatoma, respectively. The positive GPC-3 was brown granule-like staining localized in membrane and cytoplasm in human HCC.The GPC-3 positive rates were 80.6% in HCC, 41.7% in surrounding tissues and none in distal tissues (P＜0.01), respectively. No positive relationship presented between GPC-3 and differentiation grade or the number of minor except of rumor size (Z=2.941, P＜0.01). The incidence of serum GPC-3 was 52.8% in HCC patients except of one patient with cirrhosis. No significant differences were found between GPC-3 and sex, age, AFP, mm or number, Child classification or extrahepatic metastasis except of rumor size (x2 = 6.318, P＜0.05) and HBV infection (x2 = 23.362,P＜0.01). Combined detection of GPC-3 and AFP could rise up diagnosis of HCC. Conclusions GPC-3 expression closely associated with HCC and might be useful for early diagnosis of HCC.     

IGF—II基因启动子低甲基化状态与肝细胞癌变关系的研究

目的：动态观察肝细胞癌变过程中胰岛素样生长因子-II（IGF—II）表达及其DNA启动子2（P2）甲基化状态。方法：以2-乙酰氨基芴（2-FAA）喂饲雄性SD大鼠诱发肝细胞癌,分别观察肝细胞形态学（HE染色）改变、肝及血IGF—II动态变化;应用亚硫酸氢钠修饰基因组DNA,以甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）扩增分析启动子的甲基化状态。结果：肝细胞在诱癌后从颗粒样变性、不典型增生到高分化肝细胞癌形成过程中,肝和血中IGF—II表达呈梯度增加,差异有统计学意义（F=13．2,P〈0．011。正常鼠、肝细胞变性鼠、癌前病变鼠和肝细胞癌变鼠肝IGF—II基因P2低甲基化率分别为0％、27．8％、88．9％和100％,肝细胞癌变过程中肝IGF—II基因P2逐步去甲基化,各组问差异有统计学意义（χ^2=28．414,P〈0．001）,且与肝或外周血IGF—II的异常表达呈明显正相关。结论：IGF—II基因启动子逐步低甲基化改变与肝细胞的恶性转化关系密切。     

肝细胞癌变过程中胰岛素样生长因子Ⅱ的动态表达与改变特征

目的:观察肝细胞癌变过程中胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)的动态改变及与病理学特征的关系．方法:以2-乙酰氨基芴(2-FAA)喂饲♂SD鼠诱发肝细胞发生癌变,以病理学方法(HE染色)和酶联免疫吸附法(ELISA),分别观察肝细胞形态学、肝及血IGF-Ⅱ的动态变化．以免疫组织化学法分析肝组织IGF-Ⅱ表达与胞内定位．结果:组织学证实SD鼠在喂饲2-FAA后,在肝细胞出现颗粒样变性、不典型增生到HCC的形成过程中IGF-Ⅱ呈梯度表达,表现为癌组明显高于对照组和变性组(癌组vs变性组, x2=9．55,P<0．01;癌组vs正常组,x2=14．00, P<0．01),大鼠肝癌中IGF-Ⅱ在肝细胞内呈阳性表达;肝组织和外周血中IGF-Ⅱ呈显著正相关(r=0．97,P<0．01)．结论:IGF-Ⅱ参与肝细胞的癌变过程,在癌变早期表达增加有助于肝癌早期诊断及预后判断．     

转化生长因子β1诊断肝癌和肝癌监测转移的临床价值

目的观察肝癌发生过程中TGFβ1及基因动态表达的临床价值。方法以2-乙酰氨基芴（2-FFA）喂饲雄性SD鼠诱发肝细胞癌变，以病理学方法、巢式RT-PCR、免疫组织化学法和ELISA，观察肝细胞形态学、TGFβ1 mRNA、TGFβ1胞内定位、肝组织及外周血TGFβ1的动态变化与临床价值。结果SD鼠在喂饲2-FAA后，肝细胞出现颗粒样变性、不典型增生到肝癌形成。肝和血TGFβ1：正常组分别为（1．97±0．28）ng／mg和（5．98±1．76）ng／ml，变性组分别为（2．56±0、31）ng／mg和（9、41±0．37）ng／ml，癌前组分别为（3．88±0．11）ng／mg和（12．89±0、69）ng／ml，癌变组分别为（6、74±1．41）ng／mg和（16．74±2．19）ng／ml。癌变组明显高于对照组、肝细胞变性组和癌前病变组。癌变过程中TGFβ1阳性表达呈胞内分布，肝和外周血中TGFβ1呈显著正相关。肝癌患者血浆TGFβ1诊断肝癌的阳性率为89、5％，在血AFP〈400μg／L肝癌患者中，TGFβ1阳性率为93．3％，与AFP联合检查诊断肝癌阳性率达94．7％。肝癌组织TGFβ1 mRNA呈强阳性表达，伴有肝外转移患者外周血TGFβ1 mRNA检出率为100．0％。结论TGFβ1参与肝细胞癌变过程，TGFβ1及TGFβ1 mRNA过表达有助于肝癌早期诊断及预后判断。     

小鼠病毒性心肌损伤模型制作及cTnI基因扩增与测序分析

目的:分析心肌型肌钙蛋白(cTnI) mRNA在监测病毒性心肌损伤发生与发展过程中的价值。方 法:于BALB/c小鼠腹腔接种1×108TCID50柯萨奇病毒B3(CVB3)诱发心肌损伤,分别在CVB3感染后第3、6、9、 12、15、18和21天采集外周血后处死小鼠,留取鼠心脏作病理组织学检查,以逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)分 析心肌和外周血中cTnI基因及测序分析扩增片段。结果:CVB3感染后,鼠心肌组织及循环血中cTnI mRNA均 表达增加,且与心肌细胞肿胀、炎性细胞浸润、核固缩及碎裂、变性、坏死、钙化等组织学改变相关。cTnI mRNA 基因扩增,心肌组织全数阳性;外周血阳性率在对照组及感染后的第3、6、9、12、15、18和21天分别为0、0、0、 16.7%、40%、71.4%、83.3%和87.5%。测序分析证实从心肌组织及外周血中扩增基因片段与原序列完全一致。 结论:病毒性心肌损伤时cTnI mRNA上调表达并释放入血,循环血cTnI mRNA为监测心肌损伤发生与发展的 灵敏标志物。     

人外周血cTnI-mRNA对心肌微小损伤的诊断价值

目的 :探讨外周血心肌肌钙蛋白I(cTnI) -mRNA对心肌损伤诊断的临床价值。方法 :以电镜观察心肌损伤时的超微结构改变 ,并从心肌组织和外周血中制备总mRNA ,经随机引物和逆转录酶作用合成cTnI -cDNA ,再分别以巢式PCR扩增cTnI-cDNA片段 ,并与心肌酶谱 (CK、CK -MB、AST、LDH)及cTnI定性进行比较 ,分析其在心肌损伤中的临床价值。结果 :心肌损伤组织超微结构表现为心肌线粒体肿胀、嵴断裂、严重空泡样变及细胞核异形变、染色质浓缩边聚。巢式PCR扩增cTnI-mRNA片段的灵敏度为 2 pg/μl,cTnI -mRNA存在于血浆而非有核细胞 ;6 2例心脏病患者中cTnI -mRNA阳性 2 0例 ,明显高于酶学检测和cTnI定性 (P <0 .0 5 )。结论 :资料提示cTnI-mRNA存在于外周血浆 ,外周血cTnI-mRNA检测对心肌损伤诊断具有更高的敏感性。     

肝细胞癌变过程中血管内皮生长因子的表达变化

目的：观察肝细胞癌变过程中血管内皮生长因子（VEGF）的动态改变及相互关系。方法：以含0.05%2-乙酰氨基芴（2-FAA）颗粒饲料连续喂饲雄性SD大鼠12周诱发肝细胞癌变,在此过程中以免疫组织化学法、Western blot技术及酶联免疫吸附法（ELISA）观察VEGF的表达特征及其相互关系。结果：组织学证实SD大鼠在喂饲2-FAA后,肝细胞出现颗粒样变性、不典型增生及肝细胞癌（HCC）的变化;肝细胞中VEGF呈粽色阳性颗粒,主要存在于细胞浆,偶见于细胞核;癌变过程中VEGF表达率和VEGF/β-actin比率分别为：对照组25%和0.16±0.02、肝细胞变性组88.9%和0.29±0.04、癌前病变组100%和0.52±0.03及癌变组100%和0.84±0.02;VEGF表达在蛋白水平均随着病理组织学的改变呈梯度增加,表现为癌变组明显高于对照组和肝细胞变性组（P〈0.05）;肝癌中VEGF在肝细胞内呈强阳性表达;肝组织与血清VEGF的动态改变呈显著正相关关系（r=0.785,t=8.00,P〈0.01）。结论：VEGF表达异常与肝癌的发生发展有关,其表达增加有助于肝癌早期诊断,也是肝癌治疗的分子靶目标。