顶体素结合蛋白真核表达载体的构建及其在肝癌细胞株的表达

目的:构建ACRBP真棱表达载体,建立稳定表达ACRBP的人肝癌细胞株,为后继研究该基因的功能奠定基础.方法:以pMAL-C2/ACRBP重组质粒作为模板进行PCR,扩增出ACRBP编码区cDNA,并与真核表达载体pEGFP-N1连接,构建pEGFP-N1/ACRBP重组质粒.通过Fugene HD将该重组质粒转染至ACRBP表达阴性的肝癌细胞株HepG2,经G418筛选阳性克隆获得稳定转染株.RT-PCR和免疫组织化学方法检测HepC-2细胞中ACRBP的表达情况.结果:pEGFP-N1/ACRBP真核表达载体经测序证实插入序列完全正确;ACRBP基因已经稳定转染至HepG2细胞中并获得表达.结论:成功构建了pEGFP-N1/ACRBP真核表达载体并将其转染HepG2后,能稳定地表达ACRBP.     

癌-睾丸抗原SSX基因家族在视网膜母细胞瘤中的表达研究

目的检测癌-睾丸抗原SSX1-5 mRNA在视网膜母细胞瘤（RB）组织中表达情况,以及用于RB免疫治疗的可能性。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术对18例RB组织、18例非肿瘤病变视网膜组织及18例眼部正常组织中SSX1-5 mRNA的表达进行分析。结果18例RB组织中,SSX1、SSX2和SSX4 mRNA的表达率分别为33.3%（6/18）、5.6%（1/18）和22.2%（4/18）;未检测到SSX3和SSX5的表达。RB组织中,至少表达1个SSX基因者为50.0%（9/18）;表达2个或2个以上者为11.1%（2/18）。在非肿瘤病变视网膜组织以及眼部正常组织中无1例表达SSX1-5 mRNA。SSX1-5基因的表达与年龄、性别、肿瘤大小、分化程度和临床分期等均无显著相关性（P〉0.05）。结论SSX1-5在RB组织中表达频率不尽相同,但具有较强的特异性,提示该基因家族有可能成为RB免疫治疗的靶抗原。     

体外诱导胰腺干细胞向胰岛样细胞团的分化***☆

背景：目前由于胰岛来源匮乏,使得胰岛细胞移植治疗糖尿病无法满足临床需求,故体外将胰腺干细胞诱导分化为胰岛成为研究焦点。 目的：于体外将小鼠胰腺干细胞诱导成胰岛样细胞团并对其进行相关检测,探寻一种胰腺干细胞体外诱导分化成胰岛及鉴定的技术和方法。 方法：体外获得纯化的小鼠胰腺干细胞,采用联合诱导剂对其进行成胰岛方向的诱导分化,并对诱导形成的胰岛样细胞团进行形态学观察、双硫腙染色、RT-PCR和Western blot检测。 结果与结论：实验通过细胞形态学和细胞生长特性的观察以及免疫细胞化学染色证实体外成功获得了小鼠胰腺干细胞,采用联合诱导剂将其诱导成胰岛样结构,呈球形,以较细长的蒂部与瓶底连接,双硫腙染色将其染成铁红色。RT-PCR和Western blot 法可分别检测到胰岛样细胞团的胰岛素mRNA和胰岛素蛋白。结果证实小鼠胰腺干细胞可体外诱导分化成含β细胞的胰岛样细胞团。 关键词：胰腺干细胞;诱导;胰岛样细胞团;干细胞培养;小鼠 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.020     

胚胎心脏显微解剖及扫描电镜标本的制作方法

胚胎心脏微小,组织脆弱,要观察其内部纪构的变化较为困难,下面结合找们近几年来在研究胚胎心脏发生过程中所取得的一些经验,介绍胚胎心脏显微解剖及扫描电镜标本的制作方法。     

组织学实验课的改革设想

随着２１世纪的即将到来,高等院校作为培养高级人才的重要基地,面临着比以往任何时候都艰巨的任务,几十年来沿用的一套教学模式再也不能适应新形势的发展,教育改革势在必行。而在改革的方方面面中,教学内容及教学方法的改革极其重要,作为医学基础课的教师,我们深感...     

脑胶质瘤Pten/MMAC1/Tep1基因表达的免疫组化研究

肿瘤抑制基因 Pten/ MMAC1/ Tep1于 1997年由美国 3个科研小组分别克隆 ,定位于染色体 10 q2 3.3,编码的蛋白质由 40 3个氨基酸组成 ,为一种酪氨酸磷酸酶。现除了在 Cowden病——一种常染色体显性遗传性错构瘤综合症中发现了该基因的胚系突变外 ,在许多肿瘤如胶质瘤、乳腺癌、肾癌、前列腺癌和黑色素瘤等发现了各种类型的体细胞性突变。目前有关 Pten/ MMAL 1/ Tep1的研究多集中于基因的突变和缺失 ,对基因蛋白表达的研究较少。本研究应用免疫组化 ABC法观察 2 0例人脑胶质母细胞瘤 (GBM)中Pten/ MMAC1/ Tep1基因蛋白的表达。结果…     

肿瘤睾丸抗原OY-TES-1氨基端截短蛋白及其多克隆抗体的制备

目的获得原核表达的OY-TES-1氨基端截短蛋白(OY-TES-1-N),并制备其多克隆抗体。方法扩增编码OY-TES-1-N 268个氨基酸(A6-R273)的cDNA序列;将PCR产物插入原核表达载体pMAL-C2,构建重组质粒,并转化DH5α菌;通过蓝白斑筛选、DNA测序筛出阳性菌;在优化条件下用IPTG对阳性菌进行诱导表达MBP/OY-TES-1-N融合蛋白;上Amyloseresin亲和层析柱纯化,行Western blot鉴定。以融合蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备抗血清,经活化琼脂糖微球纯化后,采用ELISA法及Western blot法分别检测抗血清的效价和多克隆抗体的特异性。结果成功诱导表达出MBP/OY-TES-1-N融合蛋白。以该蛋白免疫新西兰兔制备抗血清,抗体效价为1∶1 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合。结论成功地表达并纯化了MBP/OY-TES-1-N融合蛋白,并制备了特异性多克隆抗体。     

人胶质瘤中HIF1A和MAGED4的表达及调控关系初探

目的 探讨缺氧诱导因子1A(HIF1A)和黑色素瘤相关抗原D4(MAGED4)在人胶质瘤中的表达情况,并分析HIF1A对MAGED4表达的影响。方法 通过基因表达谱交互式分析(GEPIA)数据库收集人胶质瘤组织样本数据681例,正常脑组织样本数据207例,比较其MAGED4 mRNA和HIF1A mRNA表达水平。通过中国胶质瘤基因组图谱(CGGA)数据库中下载693例胶质瘤患者的mRNA-seq＿693数据集及相应的临床信息,分析MAGED4 mRNA和HIF1A mRNA表达的相关性,以及二者与患者临床特征指标的关联性。应用氯化钴模拟体外缺氧环境,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)和蛋白免疫印记(WB)实验探讨沉默胶质瘤细胞HIF1A表达对MAGED4表达变化的影响。结果 基于GEPIA数据库的分析结果显示,低级别胶质瘤(LGG)和胶质母细胞瘤(GBM)组织的HIF1A mRNA和MAGED4 mRNA水平均高于正常脑组织,差异有统计学意义(P <0.05)。基于CGGA数据库的分析结果显示,MAGED4 mRNA表达水平与HIF1A mRNA表达水平呈正相关(...     

重组Kinectin蛋白的表达、纯化及应用研究

目的优化重组kinectin蛋白的诱导表达及纯化条件;探讨用其致敏的树突状细胞(DC)对自体T淋巴细胞增殖能力的影响。方法以pMAL-C2为载体构建重组质粒,并转入TB1宿主菌。从IPTG加入时机、诱导温度、诱导时间及IPTG浓度方面对工程菌的诱导条件进行优化;过Amylose-resin亲和层析柱对诱导产物进行分离纯化。用获取的MBP-kinectin融合蛋白致敏从人外周血中分离培养的DC,并用ELISA检测细胞上清液中的IL-12、IFN-γ含量;再用MTT法检测致敏DC刺激自体T淋巴细胞增殖的能力。结果 工程菌在37℃振荡培养2个小时后加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG,降低温度到34℃继续诱导3个小时,可明显提高诱导效率;所得MBP-kinectin与DC共培养上清液中IL-12、IFN-γ含量分别为(615.32±7.93)pg/ml,(544.28±7.17)pg/ml,用其刺激的T淋巴细胞增殖指数为53.14±0.62,均高于麦芽糖结合蛋白(MBP)组和空白对照组,且差异有统计学意义。结论pMAL-C2载体可用于构建kinectin重组质粒;通过对诱导条件的优化,可获得较高的诱导效率;所得MBP-kinectin融合蛋白能致敏DC并具有很强的刺激自体T淋巴细胞增殖的能力。