重组酶聚合酶扩增技术(RPA)快速检测GⅡ型诺如病毒

目的建立基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术的GⅡ型诺如病毒快速检测方法。方法设计针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列的RPA引物,利用RPA检测试剂盒建立RPA扩增体系,并通过2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析鉴定,从而对引物扩增效率、特异性、灵敏度和稳定性进行评价。结果本研究针对GⅡ型诺如病毒特异性保守序列设计了RPA特异性引物RPAf/RPAr,利用RPA检测试剂盒建立了RPA扩增体系。引物筛选实验结果显示,RPA检测方法在扩增反应5min后即可定性检测诺如病毒。将GⅡ.4型诺如病毒、GⅡ.17型诺如病毒、GⅡ.3型诺如病毒、GⅡ.6型诺如病毒、星状病毒、MS2噬菌体、人轮状病毒和人腺病毒基因组作为模板进行特异性检测。结果显示,只有GⅡ.4、GⅡ.17、GⅡ.3和GⅡ.6型诺如病毒有特异性扩增,表明该方法特异性良好,可基本满足对GⅡ型诺如病毒的检测。灵敏度实验结果显示,该方法可检测低至106 copies/μL的诺如病毒。利用10例诺如病毒阳性粪便样品对RPA检测方法稳定性进行评价。结果表明,10例样品均被特异性扩增,表明该方法稳定较好。结论本文建立的RPA检测方法特异性强、灵敏度高、稳定性好以及可操作性强,可用于对诺如病毒的检测。     

天津市腹泻患儿腺病毒感染情况分析

目的了解天津市腹泻婴幼儿腺病毒的感染情况及其分型特点。方法于2008年4月—2009年4月收集天津市儿童医院住院部病毒性腹泻患儿粪便标本766例,通过PCR法确定阳性标本,将阳性标本进行细胞培养产生细胞病变后,再次PCR扩增确证,并将产物测序,进行基因型别分析。结果 766例标本中腺病毒的检出率为17.62%,其中肠道腺病毒Ad41型占阳性标本的86.67%,Ad1型占13.33%,Ad40型未检出。感染腺病毒患儿的年龄中位数为8.00月龄(0.06～24月龄),全部分布在2岁以下。腺病毒感染全年存在,尤以7月感染最多,其次是2月和9月。结论肠道腺病毒是天津市住院婴幼儿病毒性腹泻的主要病原体之一,2008年4月—2009年4月以Ad41型流行为主。     

天津市婴幼儿病毒性腹泻诺如病毒检测

目的研究天津市秋冬季婴幼儿腹泻患儿中诺如病毒感染的流行情况及其基因型别。方法 2008年10-12月收集天津市儿童医院住院部310例疑似病毒性腹泻的婴幼儿粪便标本,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测粪便中诺如病毒核酸,并将部分阳性株的PCR产物进行测序,采用序列分析软件分析测序结果 ,推断其毒株型别。结果 310份腹泻标本中,诺如病毒RT-PCR阳性37份(GII型37份,GI型0例),检出率为11.94%;23份PCR产物送往测序,经Genebank Blast及系统进化树分析,所有诺如病毒均为诺如病毒基因组Ⅱ型,其中GII-4/2006b占95.65%(22/23),GII-3占4.35%(1/23);感染诺如病毒的患儿多为1岁以下,且11月份检出率最高。结论诺如病毒是天津市秋冬季婴幼儿病毒性腹泻的重要病原体,2008年诺如病毒以GII-4/2006b型毒株流行为主。     

荧光定量RT-PCR检测诺如病毒基因Ⅱ型方法的建立和评估

目的 建立灵敏、特异的诺如病毒基因Ⅱ型的荧光定量RT-PCR方法,用于临床腹泻粪便样本病毒的定量检测.方法 构建质粒DNA,并转录合成RNA作为标准品,建立和优化诺如病毒基因Ⅱ型荧光定量RT-PCR方法和反应体系,评价该方法的灵敏度、特异性、重复性,并进行临床粪便样本的检测.结果 此方法最低可以检出102拷贝数/μl,能特异地检出诺如病毒基因Ⅱ型,与诺如病毒基因Ⅰ型无交叉反应,与柯萨奇病毒B组、脊髓灰质炎病毒、肠道病毒、星状病毒、甲肝病毒、埃可病毒和轮状病毒无交叉反应.针对标准品,2次批内试验的荧光信号循阈值(Ct值)变异系数(CV)分别为1.60％、0.70％,2次批间试验的变异系数(CV)分别为0.40％、0.40％,均在5％以下.结论 本研究建立的实时定量RT-PCR检测诺如病毒基因Ⅱ型的方法,其灵敏度、特异性和重复性良好,可用于该病毒的快速检测.     

海河天津城市区域人类腹泻病毒的污染特征调查

目的研究城市典型河流生境条件下人类腹泻病毒的污染特征,阐明环境水体病毒污染规律。方法于2014年3月—2015年2月,采集海河天津城市区域水样,采用实时荧光定量PCR技术检测腹泻病毒[轮状病毒(HRVs)、诺如病毒(HuNoVs)、肠道腺病毒(HadVs)、星状病毒(AstVs)、肠道病毒(EnVs)]的浓度。结果在36份海河水样中,肠道腺病毒和星状病毒的检出率最高,均为91.7%,其次是肠道病毒83.3%,诺如病毒75.0%,而轮状病毒的检出率最低,为58.3%。肠道病毒在7—9月出现高峰期,其他腹泻病毒均在10月—次年1月出现高峰期。结论人类腹泻病毒在海河中均呈现一定的时间分布规律且具有明显的季节性。     

水环境中细菌浓集回收方法建立

目的合成新型载正电荷材料氢氧化镁铝,并组建浓集过滤系统和方法,回收水环境中的细菌。方法利用化学合成方法合成正电荷材料—氢氧化镁铝,通过研磨制成滤料,利用扫描电镜和能谱技术分析滤料的粒径、表面状态及成分,设计制作用于吸附浓集水中细菌的过滤装置,并建立水中细菌浓集、回收系统和方法。结果所制备的滤料为Mg∶Al=2.41∶1的二元混合金属氢氧化物,结构为片层状与理论一致;滤料颗粒直径250μm左右,比较均匀。建立的细菌浓集、回收系统和方法能够滤除95%的水中细菌,细菌回收率90%,处理水样可以达到15 L以上。结论合成的氢氧化镁铝及建立的浓集回收方法能够很好的回收水环境中细菌。     

量子点标记的基因芯片在食源性致病细菌检测中的应用

目的 基于链霉亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点标记的基因芯片技术,建立快速、准确、高通量的检测食源性致病细菌的方法.方法 以16s rDNA为靶基因,针对待检的食源性致病细菌合成一系列寡核苷酸探针,制成寡核苷酸芯片,生物素化标记的PCR产物与芯片杂交,然后用链霉亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点进行标记,应用激光共聚焦扫描仪进行信号的检测.对量子点标记的基因芯片技术平台的特异性、敏感性和重复性进行评估.结果 链霉亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点标记的基因芯片可有效区分常见致病细菌,检测灵敏度为10 cfu/ml,变异系数＜10％.结论 链霉亲和素修饰的CdSe/ZnS量子点标记的基因芯片可对致病细菌进行快速检测鉴定,其敏感性和重复性良好.