SARS冠状病毒M蛋白全长基因的克隆、表达与纯化

目的克隆SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列，构建原核重组表达质粒pET23a-M，并在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达、纯化。表达产物用Western Blot检测其抗原性。方法RT-PCR扩增M编码基因目的片段，胶回收纯化，插入克隆载体pMD-18T载体并转化大肠杆菌DHSa。序列测定后亚克隆至表达质粒载体pET23a，构建重组体pET23a-M，转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆，以限制性酶切分析鉴定后，转化大肠杆菌BL21（DE3）以异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达。用SDS-PAGE与免疫印迹分析表达产物。结果PCR扩增出约675bp的特异性片段，与预期片段大小相符，测序鉴定无有义突变；所构建的pET23α-M重组体阳性克隆经PCR与双酶切鉴定，与预期结果一致；SDS-PAGE显示表达产物约27kD；表达产物经金属螯和层析纯化；免疫印迹表明表达产物能被混合的SARS病人恢复期血清识别。结论成功克隆了SARS冠状病毒M蛋白基因编码序列，构建了pET23α-M表达质粒，诱导表达并纯化出了SARS冠状病毒M蛋白，并以免疫印迹鉴定。本研究的成功为进一步进行SARS病毒诊断试剂与疫苗的开发奠定了基础。     

重组SARS病毒M蛋白的免疫效应研究

目的 检测SARS冠状病毒重组M蛋白疫苗诱导小鼠的免疫应答能力。方法 PCR扩增M蛋白基因，构建至原核表达质粒pET-23a，pET-23a-M重组质粒转化BL21（DE3）宿主菌，诱导表达蛋白经SDSPAGE、免疫印迹分析和纯化后免疫BALB／c小鼠，3次免疫后测定免疫功能，进行免疫效果评价。结果 成功构建pET-23a—M重组质粒，转化宿主菌后诱导表达27kuM蛋白。检测M蛋白免疫鼠体内有特异性抗体产生，抗体效价达1，10^4；脾脏CD8^＋比例升高，CD4^＋／CD8^＋比值下降；免疫鼠血清IFN-y／和IL-4水平无显著变化。结论 SARS病毒重组M蛋白疫苗能诱导BAI。B／c小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答。     

日本血吸虫CAI基因的亚克隆表达与免疫保护效果研究

目的　克隆和表达日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)CAI基因,并对表达产物进行免疫保护效果测定,评价其作为血吸虫疫苗候选分子的潜能。　方法　将SjCAI基因亚克隆至pGEX5X3载体,转化入感受态大肠杆菌ER2566,在异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下进行表达,用表达产物免疫小鼠,并设分别注射等体积的弗氏完全佐剂和PBS的两组对照组,观察免疫保护效果。　结果　在IPTG诱导下,表达载体中的SjGST基因与重组的SjCAI基因在大肠杆菌中获得了高效融合表达,将其免疫小鼠,诱导产生了29.87%的减虫率和63.71%的减卵率。　结论　SjCAI基因亚克隆至pGEX5X3载体后可在大肠杆菌中高效表达,表达产物能诱导产生一定水平的抗Sj保护性免疫力     

SARS冠状病毒S蛋白部分序列2的克隆与表达

目的 构建SARS冠状病毒棘突蛋白部分序列2(S2)的原核表达质粒，分析其在大肠杆菌中的表达状况。方法 采用逆转录聚合酶链式反应技术从SARS冠状病毒基因组中扩增出编码S蛋白的第2170到2814位碱基的基因片段，克隆至pMD18-T载体，PCR筛选阳性克隆并测序。用限制性内切酶消化后，目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌．JM109，PCR和双酶切鉴定转化菌落。将阳性菌落经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达。结果 RT—PCR扩增出S2特异片段，经测序与GenBank比对存在1处碱基突变。S2基因片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2构建成重组表达质粒，并在JM109中表达了S2融合蛋白。结论 成功构建了SARS冠状病毒S2的重组表达质粒，并在大肠杆菌中表达了S2融合蛋白。     

结核病诊断性血清学特异抗原的筛选和鉴定

目的 筛选和鉴定结核病患者血清抗体特异性识别的结核分枝杆菌抗原。方法 于改良罗氏培养基中培养结核分枝杆菌标准株H37Rv 4周,收集菌体,通过冰浴超声法提取结核分枝杆菌菌体抗原。收集2013年2—7月湖南省结核病防治所首次入院的30例初治结核病患者的血清,以及收集2013年7月湖南省人民医院检验科接收的20名健康体检者的血清。通过饱和硫酸铵沉淀法提取纳入的20例结核病患者的血清IgG,从结核分枝杆菌菌体抗原中免疫共沉淀血清学抗原,以纳入的其余10例结核病患者血清免疫印迹(Western blot,WB)验证其免疫反应性;从十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)胶上切割阳性反应的蛋白质条带,通过串联质谱技术进行鉴定。结果 免疫共沉淀获得1条相对分子质量为16000(16kDa)、能被结核病患者血清抗体特异性识别的蛋白质条带;经串联质谱鉴定,获得结核分枝杆菌热休克蛋白(heat shock protein,Hsp)16.3、糖基转移酶蛋白、铁调控Lsr2蛋白前体等3种蛋白抗原。结论 采用免疫共沉淀偶联质谱技术获得3种结核分枝杆菌血清学抗原,可为结核病血清学诊断性抗原的选择进一步提供依据。