乙型肝炎病毒前C区G1896A位点变异检测方法的建立及应用

[目的]建立等位基因特异性PCR（AS-PCR）法检测乙型肝炎病毒（HBV）前C区G1896A位点变异并对部分慢性乙型肝炎标本进行检测。[方法]根据HBV前C区G1896A位点设计只有3＇末端有一个碱基不同的两对等位基因特异性引物，根据PCR结果判断该位点为G或A。[结果]本文测定的两株克隆序列与AS-PCR结果一致；HBeAg阳性慢性乙肝G1896A突变率为50％（15／30），HBeAg阴性组为90％（27／30），两组变异率有显著性差异（X^2=29．382，P=0．000）。[结论]本文建立的方法可用于检测HBV前C区G1896A位点的突变。     

3株TT病毒的基因组结构特点及其在肝炎病人中感染情况

目的：了解TT病毒(TTV)分离株基因组结构特点及其在各型病毒性肝炎患中感染情况。方法：对49株TTV相关病毒全基因组结构进行分子进化树分析，比较从我国分离的3株TTV全基因结构与原型株的同源性，并采用巢式聚合酶链反应法(nPCR)对各型病毒性肝炎患血清中TTV DNA进行检测。结果：3株TTV分离株基因组全长为3739bp，有2个读码框架（ORFs），ORF1编码770个氨基酸，位于589-2901核苷酸；ORF2编码202个氨基酸，位于107-715核苷酸。与TTV原型株TA278的核苷酸同源性为86％-96％，ORF1氨基酸同源性为88％-97％，ORF2氨基酸同源性为79％-96％。全基因组序列分子进化树分析表明，从我国分离的3株TTV属于原型组。在180例各型病毒性肝炎患中，检出TTV DNA阳性40例，阳性率为22.2％。在甲-戊型肝炎、非甲、戊型肝炎、慢性乙型肝炎患和正常人中，TTV DNA流行率分别为24.2％（29/120），18.3％（11/60），17.8％（106/595）和19.8％（19/96），4组无显性差异。结论：从我国分离的3株TTV的全基因结构特点与原型株相似，各型病毒性肝炎、慢性乙型肝炎和正常人群TTV DNA流行率相对较高。     

中国11城市乙型肝炎病毒慢性感染者中乙型肝炎病毒基因型分布

目的了解中国乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染者中HBV基因型的分布情况。方法收集北京、清远、深圳、石家庄、汉川、南京、长春、济南、聊城、宁波和温州市共1214份HBV DNA阳性的慢性HBV感染者血清样本,用型特异性引物聚合酶链反应法（PCR）进行基因型测定,并对其中部分样本以PCR产物直接测序验证。结果在1214份血清中,检测到A基因型9例,占0．7%;B基因型345例,占28．4%;C基因型709例,占58．4%;B、C混合基因型（B＋C）151例,占12．4%。未检测到其他基因型。北方地区（长春、北京、石家庄市等）慢性HBV感染者中,C基因型比例较高,分别为58．2%、67．5%和63．6%,山东省聊城和济南市的C基因型比例分别高达90．2%和87．9%。随地理位置南移,B基因型比例逐渐增加,广东省清远和深圳市的B基因型比例分别为71．4%和63．6%。结论HBV基因型分布有明显地区差异。在中国慢性HBV感染者中,HBV C和B基因型为主要流行株。北方地区以C基因型为优势株,而南方地区则B基因型较为多见。     

乙型肝炎病毒基本核心启动子A1762T／G1764A位点基因多态性检测方法的建立及应用

[目的]建立多聚酶链式反应-限制性片段长度多态分析（PCR-RFLP）法检测乙型肝炎病毒（HBV）C区基本核心启动子区（BCP）A1762T／G1764A联合突变并对部分临床标本进行检测。[方法]根据HBVBCP区基因设计引物，在G1764位设计MboⅠ酶切位点，根据PCR产物酶切结果判断该位点为G或A。[结果]测序及序列比较显示本文一株突变株：DT-BCP确为1762T／1764A变异株；HBeAg阳性慢性乙肝A1762T和G1764A位点双突变率为60％（18／30），HBeAg阴性组为53．3％（16／30），两组变异率无显著性差异（X^2=0．271，P=0．602）。[结论]本文建立的方法可用于检测HBV BCP区A1762T／G1764A位点双突变。     

e抗原阴性慢性乙型肝炎患者血清表面抗原大蛋白水平与乙型肝炎病毒DNA之间的关系

我国约1／3的慢性乙型肝炎患者乙型肝炎e抗原（HBeAg）阴性，但仍然伴有高水平的乙型肝炎病毒（HBV）复制。在不能进行HBV DNA检测的单位，对这些患者HBV复制程度的判定难以进行。现探讨HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者血清中乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白（LHBs）与HBV DNA的关系，试图明确LHBs是否可以用作HBeAg阴性乙型肝炎患者病毒复制程度的判定指标。     

血管紧张素ⅡⅠ型受体基因A1166C位点基因多态性与肝硬化的关系

目的:建立多聚酶链式反应．限制性片段长度多态分析(PCR-RFLP)法检测血管紧张素ⅡⅠ型受体基因(ATIR)A1166C位点的多态性．方法:对50例血清抗HBs阳性的健康对照者及46例HBV感染后肝硬化患者的血管紧张素ⅡⅠ型受体基因A1166C位点基因多态性的多态性进行分析．根据血管紧张素ⅡⅠ型受体基因设计引物,在A1166C位设计DdeⅠ酶切位点,根据PCR产物酶切结果判断该位点为A或C．结果:两株纯合子与AT1R序列同源性在99%以上,并在A1166C位点出现预期变异;肝炎和肝硬化两组间A1166C位点无论是基因型还是等位基因均无显著性差异(P>0．05)．结论:PCR-RFLP的方法可用于AT1R基因A1166C位点基因多态性的检测,该位点的变异尚未显示其与肝纤维化有关．     

检测病毒性肝炎患者血清中SEN病毒及其临床意义

目的：检测病毒性肝炎患者血清中SEN病毒D和H(SENV-D、SENV-H),并探讨其临床意义。方法：采用巢式聚合酶链反应法（nPCR）检测甲、乙、丙、戊型肝炎和非甲－戊型肝炎患者血清中SENV-D和SENV-H DNA。结果：在180例病毒性肝炎患者血清中，SENV-D和SENV-H检出率分别为17.2%(31/180)和5.6%(10/180)，总检出率为18.3%(33/180)、甲、乙、丙、戊型肝炎患者的SENV-D/H检出率高于非甲－戊型肝炎患者。从甲、乙、丙、戊型肝炎和非甲－戊型肝炎患者分离的SENV-D/H核苷酸序列，与SENV-D/H原型株比较，其同源性在94％以上。甲、乙、丙和戊型肝炎患者有无SENV-D/H合并感染，其血清生化学指标无明显差异。结论：SENV-D/H可能不是非甲-戊型肝炎的病原，甲、乙、丙和戊型肝炎患者合并感染SENV-D/H并不加重病情。     

套式聚合酶链反应法检测外周血单个核细胞中HBV cccDNA

目的：建立套式聚合酶链反应法（nPCR）检测慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMC）中乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（HBV cccDNA）。方法：根据HBV基因组DNA正负链上下游缺口序列，设计两套相对保守的引物，建立HBV cccDNA套式PCR，并用该法检测200例慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA。结果：该法检测200例慢性乙型肝炎患者，HBV cccDNA阳性率为60％。结论：套式PCR法简便、灵敏，可用于测定PBMC中HBV cccDNA。     

SARS的临床特点与治疗研究

目的旨在总结SARS发病的临床特点和分期治疗的疗效,并进一步探讨SARS的发病机制.方法北京地坛医院在2003年4月9日至4月26日收治的SARS确诊病例52例,男29例、女23例,年龄11～88岁[平均(37±14)岁].根据病情轻重程度,分成上述临床分期及治疗方案对这些病例的临床、实验室资料及病情转归进行了研究;部分病例进行了RT-PCR核酸检测、以及炎性细胞因子和辅助细胞因子的流式细胞CBA检测.4例死亡病例进行了病理组织学检查.结果与结论第Ⅰ期为病毒复制期,时间大约1周,患者发热并可伴有全身中毒症状,血中淋巴细胞及T细胞亚群CD3、CD4、CD8开始降低;胸部X线显示肺损伤较轻,可见肺纹理增粗或仅出现一叶病变,阴影稳定或进展缓慢.此期病毒在体内大量繁殖,RT-PCR检测80%患者血液检测阳性,阴性者咽拭和/或痰检测亦呈阳性.采用利巴韦林、α-干扰素和膦甲酸钠联合抗病毒治疗.一般轻型患者经过此期后可直接进入恢复期.第Ⅱ期为介质损伤期,时间也是1周左右,主要表现为伴有系统炎症反应综合征的急性肺损伤.患者再次发热,血中淋巴细胞及T细胞亚群CD3、CD4、CD8呈进行性下降,轻型及普通型患者在第8天降至最低水平.二次发热后患者X线肺部病变进展迅速,重型患者出现明显的呼吸困难、低氧血症,大多需无创正压通气治疗.可能系细胞因子等促炎介质过度释放导致弥漫性肺泡损伤.一部分重型病人的细胞因子检测发现,TNF-α、IL-6、INF-γ、IL-2、IL-4于病程第4～6天显著增高.此期在继续抗病毒的基础上短程应用肾上腺皮质激素,可同时使用胸腺肽a1等免疫调节剂.普通型患者在此期后临床症状迅速缓解,X线肺部阴影逐渐吸收而进入恢复期.第Ⅲ期为免疫麻痹期,大约第3周开始,以ARDS及严重继发感染为特征,往往需要有创机械通气支持.可出现第3次发热、中性粒细胞增高、痰细菌学培养阳性;极重型患者可出现脓毒症(Sepsis)、甚至多脏器功能不全(MODS).重型和极重型患者血中淋巴细胞及T细胞亚群CD3、CD4、CD8在第12天达到最低点后,重型患者的在第3病程中逐渐回升,而极重型患者则始终处于低水平.细胞因子检测示抗炎因子IL-10在第2病程显著增高,可能与随之而来的免疫过度抑制有关.此期尽早采用保护性肺通气措施,进行有创通气支持,激素应迅速减量或停用,应用抗生素和静脉丙种球蛋白抗感染.52例SARS病例,组A 35例,为发病1周内入院,施行了早期抗病毒治疗,应用或未用激素.其中33例跳过免疫麻痹期直接进入恢复期,2例发生ARDS者,需无创或有创通气治疗,经积极抗感染后,CD4及CD8上升,均已痊愈出院;组B 17例,为发病1周后入院,未进行抗病毒治疗,尽管早期使用了激素.其中7例发生ARDS,虽进行有创通气支持治疗,终因严重感染和/或合并多脏器功能不全而死亡.SARS是一种新出现的急性呼吸道病毒性传染病,传染性强,常群聚发病,肺损伤重.约有20%以上的患者出现呼吸衰竭、甚至死亡.呼吸衰竭的原因主要为急性肺损伤(acute lungs injury,ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syn-drome,ARDS).据部分资料统计,将近10%～40%的病人需要辅助通气机械治疗,最后需要ICU干预的约有20%.WHO将其命名为严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS).根据病毒性呼吸道病传染病的分期规律以及SARS病人的临床表现特征,我们将SARS病程划分为"病毒复制期"、"介质损伤期"、"免疫麻痹期"以及"恢复期"四个阶段(前3期每期时间均为1周),并按相应方案进行针对性治疗.旨在总结SARS发病的临床特点和分期治疗的疗效,并进一步探讨SARS的发病机制.