载脂蛋白A5基因-1131T〉C多态性与冠心病易感性的关联研究

目的探讨载脂蛋白A5(apoA5)-1131T>C单核苷酸多态性与冠心病(CAD)发病风险之间的关系.方法经冠状动脉造影确诊的江苏地区冠心病患者235例,同一地区正常对照262名,采用PCR-RFLP分析对 apoA5基因的-1131T>C多态进行检测,比较不同基因型与个体血脂水平和冠心病患病风险的关系.结果 -1131T>C单核苷酸多态位点等位基因T、C频率在CAD组和正常对照组中分别为59.57%、40.43%和65.65%、34.35%.CAD组中C等位基因的频率高于对照组(P<0.05).与-1131TT基因型者比较,CC基因型者的冠心病患病风险显著增加(OR＝1.872,95%CI＝1.039-3.376,P=0.037),用Logistic回归模型对个体的年龄、性别、体重指数和抽烟、高血压等因素后,其患病风险仍明显增加(OR＝2.285, 95%CI＝1.222-4.274).对照组中不同基因型个体血浆甘油三酯水平差异有统计学意义(P=0.007),携带C等位基因的个体TG水平显著高于TT基因型个体.结论 apoA5基因-1131T>C多态性C等位基因是中国人群中冠心病发病的危险因素之一,且与血浆TG水平的变化密切相关.     

组织因子途径抑制物基因局部转染对兔颈总动脉损伤后内膜增生及P53表达的影响

目的研究组织因子途径抑制物(TFPI)基因局部转染对兔颈总动脉损伤处内膜增生及P53表达的影响。方法36只新西兰纯种雄性大白兔颈总动脉损伤后随机分生理盐水组?复制缺陷型腺病毒(AdLacz)组和包载TFPI目的基因复制缺陷型腺病毒(AdTFPI)组。每组12只。术后14d处死动物,取损伤血管进行检测分析。免疫组化染色观察TFPI在转染局部的表达成功;颈总动脉损伤处抽提总RNA,半定量逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)测定P53mRNA表达;同时对颈总动脉病变最明显的取材标本进行HE染色,光学显微镜下观察血管内膜增生,以计算机图像分析系统分析血管内膜?中膜面积和腔面积。结果AdTFPI组家兔的颈总动脉损伤处血管内膜的增生显著受抑制?内膜/中膜面积比值下降;生理盐水组?AdLacz组和AdTFPI组P53mRNA的相对值分别为1.31±0.14、1.27±0.11和4.21±0.87,P53在AdTFPI组表达增强,与前两者相比有显著差异性。结论TFPI基因局部转染显著抑制颈总动脉损伤处血管内膜的增生并增强P53表达。     

日本血吸虫(中国大陆株)22.6 ku抗原编码基因的核酸疫苗pCMV/Sj22.6的构建

目的　探索日本血吸虫 (中国大陆株 ) 2 2 .6ku抗原 ( Sj2 2 .6)编码基因用作核酸疫苗的可行性。方法　用新设计的引物以 PCR法对 Sj2 2 .6编码基因进行改造 ,然后亚克隆入真核表达载体 p CMV -β并转化入大肠杆菌 JM 10 9。结果　提取重组质粒经酶切分析 ,筛选出了含有正向插入片段的阳性重组质粒。结论　此阳性重组质粒可用于核酸疫苗等进一步研究     

Targeted Expression and Secretion of Human Apoprotein AI,Apoprotein E and Lecithin-choles-terol Acyltransferase from Myogenic Cell

Objective To investigate the possibility of heterologous expression for apoAI, apoE and LCAT by skeletal muscle cells and secretion into blood and to develop a safe and convenient gene therapy method for atherosclerosis. Methods Viral and nonviral vectors containing apoAI, apoE or LCAT genes were constructed and transfected into myogenic cells in vitro or injected directed into mouse skeletal muscle. The expression efficiencies of these vectors were investigated by ELISA assay for human apoAI and apoE3 and by the proteoliposome method for human LCAT. Genomic DNA was extracted from stable transduced myoblasts and analyzed for the presence of vector sequence by PCR amplifications. Immunocytochemistry assay was also performed to make an intuitionistic detection for the expression of transgene in myoblasts. Results All viral or nonviral vectors constructed in present study expressed the transgenes efficiently in mice skeletal muscles in vivo or cultured myoblasts in vitro. The transgene expression level of cells transfected with AAV-based plasmid vectors were 2-4 times higher then that of cells transfected with conventional plasmid vectors. Additionally, cells transfected with AAV-based bicistronic vector or tricistronic retroviral vector expressed both human apoAI and LCAT simultaneously. The sequences of retroviral or AAV-based plasmid vectors were found to be retained in host cells after transfection when that of conventional plasmid vectors were lost. Furthermore, transduced myoblasts maintained the ability for heterologous expression of human apoAI and LCAT even after differentiation into myotubes. For cells transfected with retroviral vectors, stable transduced clones can be selected by G418 and continued to efficiently express human apoAI and LCAT for 3 months. Conclusion These finds indicated that mice skeletal muscles or cultured myoblasts transduced with viral or non-viral vectors could efficiently express and secret human apoAI, apoE and LCAT. It suggested that the use of nonviral, adenoviral or AAV-based vectors to directly inject into skeletal muscle or the use of polycistronic retroviral to genetically modify myoblasts ex vivo and then implantation back to skeletal muscle to high efficiently and long-term express apoAI, apoE and LCAT in vivo might be a safe and feasible strategy to prevent or reduce the formation of atherosclerotic lesions.     

人卵磷脂胆固醇酰基转移酶基因在肌源细胞中的表达

为探索人卵磷脂-胆固醇酰基转移酶在骨骼肌细胞表达的可能性，构建了一个由人巨细胞病毒早期增强子和促进子驱动的卵磷脂-胆固醇酰基转移酶cDNA表达质粒。以阳离子介导其转染小鼠肌源性细胞株C2，获得成功表达，并在细胞培养液内测得有生物活性的卵磷脂胆固醇酰基转移酶。提示有可能通过将卵磷脂胆固醇酰基转移酶基因转移至骨骼肌细胞的方法来提高人体内卵磷脂胆固醇酰基转移酶水平。     

超声介导白蛋白微泡破裂法促进增强型绿色荧光蛋白C3基因在中国仓鼠卵巢细胞的表达

基因治疗的研究已取得不少进展，但要成功地应用于临床仍存在许多困难，安全、有效的基因载体及良好的靶向性就是其中最重要的难点之一。本研究超声介导白蛋白微泡破裂可以增加真核细胞膜对大分子（如DNA）通透性的原理，探讨一种新的转基因方法，以便安全有效和定向地转移目的基因。实验中选择绿色荧光蛋白C3基因为标记基因，以白蛋白微泡为载体，用超声介导微泡破裂的方法在体外进行中国仓鼠卵巢细胞的基因转化，同时以脂质体为对照，激光共聚焦显微镜和流式细胞计数仪分别定性和定量观察细胞转化效率。台盼蓝染色观察细胞的活性。体外试验发现0．8MHz,1.0W/cm^2、10％脉冲周期、60s超声介导10％白蛋白微泡破理解可以有效稳定转化增强的绿色荧光蛋白C3基因在中国仓鼠卵巢细胞表达，平均转化阳性率可达56．2％，活性实验证明对细胞无毒副作用，提示超声介导白蛋白微泡破理解法有应用于临床基因治疗的广阔前景。     

一家族性高胆固醇血症家系低密度脂蛋白受体基因突变分析

为分析一家族性高胆固醇血症家系低密度脂蛋白受体的基因突变，提取患儿及其父母外周血基因组DNA，用聚合酶链反应扩增低密度脂蛋白受体基因的18个外显子。用单链构象多态性分析检测聚合酶链反应产物，对单链构象多态性分析电泳结果异常者进行DNA序列分析。结果发现，单链构象多态性分析发现患者及其母亲第10外显子存在一异常条带。DNA测序结果证实患者第10外显子的471位密码子由AGA同义突变为AGG，483住密码子由TGG突变为TAG，导致在483住提前出现终止密码子。本研究利用聚合酶链反应一单链构象多态性分析方法报道了一个新的低密度脂蛋白受体突变位点。     

修饰的单链DNA寡核苷酸靶向修复低密度脂蛋白受体基因点突变

目的低密度脂蛋白（LDL）是血浆中胆固醇的主要载体，低密度脂蛋白受体（低密度脂蛋白爱体）的生理功能是介导细胞对LDL的内吞，以满足细胞对胆固醇的需求并调节血浆胆固醇水平。LDL受体基因突变可因血浆中LDL清除障碍而导致高胆固醇血症，是最常见的单基因遗传病之一，称为家族性高胆固醇血症（familial hypercholesterolemia，FH）。     

高胆固醇血症小鼠肝脏的差异表达蛋白

运用以双向电泳为基础的蛋白质组学研究手段,比较分析高胆固醇血症小鼠与正常小鼠肝脏差异表达蛋白。用高脂饲料复制小鼠高胆固醇血症模型,饲喂14周后高脂组小鼠血浆中总胆固醇为9.5±3.9 mmol/L,肝脏中总胆固醇为35.3±3.7 mg/g,均明显高于对照组(P<0.001)。提取两组小鼠肝脏总蛋白,双向凝胶电泳分离蛋白质,所获得的凝胶图谱经软件分析后确定差异点及其等电点与分子质量,利用质谱技术对差异蛋白进行肽质量指纹谱分析鉴定,再与蛋白质数据库中的小鼠肝脏标准图谱匹配验证。双向凝胶电泳分离蛋白质样品的分辨率好、重复性较高,两组间至少有16个点有稳定的差异表达(2倍以上),鉴定其中4个点个为主要尿蛋白系列、2个点为碳酸酐酶Ⅲ、2个点为谷胱甘肽S-转移酶P2。实验结果提示:主要尿蛋白、碳酸酐酶Ⅲ及谷胱甘肽S-转移酶等受雄激素调控的蛋白质表达下调,可能与饮食引起的高胆固醇血症相关。     

人LDL受体cDNA在中国仓鼠卵细胞中的表达

将去除大部分3’端非编码区的LDL受体cDNA片断插入pSVL质粒,获得重组质粒pLDL RN,并在LDL受体阴性的中国仓鼠卵巢细胞CHO 7a-1细胞中获得表达。表明3’端非编码区对LDL受体基因表达并非必不可少。