骨髓间充质干细胞自体移植促进兔缺血肢体的血管生成

背景：常规药物治疗、介入或血管旁路移植手术对下肢动脉闭塞症的远期疗效均不理想。近年来采用干细胞的血管再生疗法在梗死部位修复或重新建立有效侧支循环逐渐成为可能。 目的：验证骨髓间充质干细胞自体移植对兔缺血后肢血管再生的促进作用。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2005-08/2006-11在江苏省血吸寄生虫病防治研究所完成。 材料：选用新西兰大白兔8只，制备兔后肢缺血模型。按随机数字表法分为2组，实验组及对照组各4只。 方法：分离培养实验组兔骨髓间充质干细胞，5-溴-2-脱氧尿苷标记，将骨髓间充质干细胞制成悬液注射于实验组兔后肢缺血部位；对照组注射等量生理盐水。 主要观察指标：2 周后行兔股动脉二维及彩色多普勒超声检测，观察移植前后的血管内径、血流峰值速度及血流加速时间等；取缺血部位肌肉组织，通过免疫荧光及苏木精-伊红染色观察移植细胞分布及血管生成情况。 结果：细胞移植2周后实验组兔的股动脉内径、血流峰值速度均大于对照组(P < 0.01)，血流加速时间短于对照组(P < 0.01)。免疫荧光染色结果显示实验组兔移植部位有抗5-溴-2-脱氧尿苷染色阳性细胞存在；苏木精-伊红染色结果显示实验组缺血部位血管密度高于对照组。 结论：骨髓间充质干细胞具有促进血管生成的作用，自体移植可望成为一种简单的、有效的治疗下肢缺血的方法。     

人脐血间充质干细胞移植促进大鼠颅脑创伤后神经功能的恢复

目的 将人脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)注射到创伤性脑损伤(TBI)大鼠顶叶皮层及海马区,观察神经细胞标志物的表达和促进神经功能的恢复.方法 HUCB-MSCs用双苯酰亚胺(bis-benzimide)标记24 h,通过立体定向将细胞注射到损伤脑组织内.全部大鼠分为假损伤组、损伤组(TBI)、对照组(TBI+PBS)和治疗组(TBI+MSCs).用免疫组化和免疫荧光标记的方法检测移植细胞的存活、迁移和分化情况,用神经损伤严重程度评分(NSS)对神经功能恢复结果进行评价.结果 在接受移植的脑创伤大鼠局部有大量的MSCs存活,一些细胞分化为神经元或神经胶质细胞,并表达NSE和GFAP等神经细胞的标志物,治疗组的神经功能评分较其他组有明显的改善.结论 HUCB-MSCs可明显改善脑创伤后神经功能的恢复,并能很好替代骨髓MSCs而用于干细胞移植.     

骨髓来源成骨细胞复合纳米晶羟基磷灰石胶原构建组织工程骨的实验研究

目的 :探讨纳米材料作为组织工程骨基质材料的可行性。方法 :分离培养兔骨髓间充质干细胞 ,诱导为成骨细胞后作为种子细胞 ,与纳米晶羟基磷灰石胶原材料于体外联合培养 ,复合物植入兔桡骨节段性缺损处 ,通过大体观察、HE染色及X线摄片了解成骨情况。结果 :兔骨髓间充质干细胞在体外可以大量扩增 ,能定向诱导为成骨细胞 ;复合物植入 16周后 ,X线摄片中可见桡骨缺损处连接良好。结论 :纳米晶羟基磷灰石胶原材料是组织工程骨的较好的支架材料。     

人脐血间充质干细胞移植促进大鼠颅脑创伤后神经功能的恢复

目的 将人脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)注射到创伤性脑损伤(TBI)大鼠顶叶皮层及海马区,观察神经细胞标志物的表达和促进神经功能的恢复.方法 HUCB-MSCs用双苯酰亚胺(bis-benzimide)标记24 h,通过立体定向将细胞注射到损伤脑组织内.全部大鼠分为假损伤组、损伤组(TBI)、对照组(TBI+PBS)和治疗组(TBI+MSCs).用免疫组化和免疫荧光标记的方法检测移植细胞的存活、迁移和分化情况,用神经损伤严重程度评分(NSS)对神经功能恢复结果进行评价.结果 在接受移植的脑创伤大鼠局部有大量的MSCs存活,一些细胞分化为神经元或神经胶质细胞,并表达NSE和GFAP等神经细胞的标志物,治疗组的神经功能评分较其他组有明显的改善.结论 HUCB-MSCs可明显改善脑创伤后神经功能的恢复,并能很好替代骨髓MSCs而用于干细胞移植.     

hCMSC体外培养的优化及生物学特性的初步分析

目的:探索从人胎盘绒毛组织体外分离培养获得间充质干细胞(hCMSC)和hCMSC体外有效扩增的方法,并对hCMSC生物学特性作初步分析.方法:免疫组织化学染色确定胎盘绒毛组织中间充质干细胞的组织分布,选取相应的绒毛组织和采用Ⅳ型胶原酶消化法,获得细胞悬液,进行原代传代培养;流式细胞术检测细胞表面标志,采用细胞计数和MTT法分析细胞的增殖;叔丁对甲氧酚(Butylated hydroxyanisole,BHA)和DMSO联合诱导hCMSC向神经元样细胞分化;RT-PCR分析flt3基因表达.结果:免疫组织化学染色结果显示,胎盘绒毛中轴血管周围富有CD105、CD90阳性的间充质干细胞,采用机械分离和Ⅳ型酶消化法获取绒毛层富含hCMSC的组织细胞;bFGF是良好的hCMSC体外增殖因子,而FL对人胎盘绒毛层间充质干细胞具有更明显的促增殖作用;体外扩增的hCMSC高表达CD73、CD90、CD105,低表达CD14、CD34、CD45、HLA-DR,以及免疫负性调控分子PDL-1呈现表达,并且具有向神经元样细胞分化的潜能.结论:胎盘绒毛组织中存在低免疫原性的间充质干细胞,bFGF和FL(flt3 ligand)能有效促进胎盘绒毛层间充质干细胞体外增殖且保持其分化潜能.     

人胚脑皮层神经干细胞的分离培养及鉴定

目的 从人胚脑皮层中分离培养并鉴定神经干细胞，方法 利用无血清培养和单细胞克隆技术在人胚脑皮层中分离出具有单细胞克隆能力的细胞，并进行培养、传代、分化观察，采用间接免疫荧光检测克隆细胞的神经巢蛋白（Nestin)抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。结果 从胚龄10周的新鲜人胚脑皮层中成功分离出神经干细胞，该细胞具有连续克隆能力，可传代培养，表达神经巢蛋白抗原，分化后的细胞表达神经元细胞，胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论 人胚脑皮层中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞。     

移植维甲酸诱导的人胚神经干细胞在受损大鼠脊髓内的分化及作用

目的 将维甲酸(RA)诱导的人胚神经干细胞移植入受损的大鼠脊髓内，观察大鼠后肢运动功能的变化及细胞的分化情况。方法 实验大鼠30只遭受脊髓中度损伤后7天作移植治疗，实验组分两组：一组移植经维甲酸诱导后的细胞，另一组移植未诱导的细胞；对照组注射等量PBS液。每周一次观察大鼠后肢运动情况，移植后4周，应用免疫组化技术检测移植细胞在大鼠脊髓内的生存和分化情况。结果 实验组大鼠脊髓内见许多移植细胞存在，部分可分化出神经元样细胞，其后肢运动功能优于对照组。其中维甲酸诱导组能分化出神经元样细胞，其促进脊髓功能恢复的能力较另一组更强。结论 维甲酸预处理的神经干细胞在体内能替代缺失的神经细胞，促进受损的脊髓功能恢复．在脊髓损伤的临床治疗中具有潜在的应用价值。     

胎盘间充质干细胞向神经细胞诱导的实验研究

目的间充质干细胞(MSCs)具有自我更新和多向分化能力的特点，尽管其主要来源骨髓间充质干细胞(BMSCs)已被认为是治疗多种疾病的良好细胞来源。但在严重感染或随着年龄的增长骨髓细胞数及增殖、分化能力均明显下降等情况下，就无法顺利获得足量可用于治疗的BMSC，有必要寻找MSC的新来源。方法消化胎盘组织、贴壁培养获得基质细胞；用流式细胞仪检测其细胞表面标志；比较叔丁对甲氧酚(butylated hydroxyanisole，BHA)、复方丹参注射液、β-巯基乙醇(BME)等对培养的基质细胞向神经细胞分化的作用；采用免疫细胞化学的方法对分化的细胞进行鉴定。结果胎盘组织中分离出的基质细胞与骨髓间充质干细胞有相似形态和细胞表面标志，并可诱导表达神经元和星型胶质细胞标志神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolasen，NSE)、神经微丝(neurofilament，NF)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrilament acidic protein，GFAP)。结论胎盘组织中存在能分化为神经元样细胞的间充质干细胞。胎盘间充质干细胞可能是一种可为临床治疗提供丰富新来源的间充质干细胞。     

新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究

研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法,为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来源。取新生SD大鼠的海马区脑组织,采用accutase结合机械分离法获取神经干细胞,在含有B－27、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM／F12无血清培养液中培养;Accutase酶消化后传代培养,取第3代细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含10％胎牛血清培养液诱导分化,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色检测NSCs向神经元及胶质细胞分化的能力。分离的新生大鼠海马区脑组织中细胞,在无血清培养液中形成大量的神经球,部分神经球出现融合及贴壁分化现象,细胞呈典型NSCs 形态。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞。神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后,可分化为神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。从新生大鼠海马组织分离培养的NSCs具有自我更新和增殖能力,在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

高-低密度法分离培养大胚龄人神经干细胞

目的 从大胚龄人胚脑中分离培养并鉴定神经干细胞。方法 采用高—低密度培养、无血清培养和单细胞克隆技术分离培养出神经干细胞，并应用免疫荧光染色鉴定。结果 从13周龄胚脑中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，它们具有连续克隆能力，可传代培养，表达神经巢蛋白抗原，分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少校胶质细胞的特异性抗原。结论 高—低密度培养法能成功地分离和培养大胚龄入神经干细胞。