人胚中脑神经干细胞的体外分离培养及分化的研究

本对人胚中脑神经干细胞体外分离培养及分化进行了初步研究．以期为神经干细胞临床应用提供实验依据。     

体外培养牙周膜细胞增殖分化与中药双黄补水提液的调控效应

背景:牙周组织的修复再生取决于牙周膜细胞的数量和增殖分化能力。牙周膜细胞具有多向的分化潜能,可分化成成牙骨质细胞、成骨细胞和成纤维细胞,形成牙骨质、牙槽骨和牙周膜,实现牙周组织再生。目的:观察体外培养人牙周膜细胞增殖和分化过程中传统中药双黄补水提液对其功能的影响。设计:观察性实验。单位:无锡市第三人民医院中心实验室。材料:牙周膜组织(由健康青少年患者因矫正畸形门诊就诊时自愿提供);黄连、黄岑、骨碎补(中国药品检定所提供)。方法:实验于2003-07/10在无锡市第三人民医院中心实验室完成。分别将粉碎的黄连、黄岑、骨碎补和蒸馏水1∶10(m∶V)混合,沸水回流5h。收集提取液,粗滤后残渣再次沸水回流3h。合并2次提取液,旋转蒸发浓缩,所得中药水提液浓度为3kg/L。分黄连组、黄芩组、骨碎补组、黄连加黄岑组、黄连加骨碎补组、黄岑加骨碎补组、双黄补组和对照组8组进行实验。通过体外培养人牙周膜细胞,应用双黄补提取液作为辅助因子,采用MTT比色法测定细胞增殖情况,羟脯氨酸法测定胶原蛋白占总蛋白比值。主要观察指标:牙周膜细胞增殖的吸光度值及胶原蛋白占总蛋白的比值。结果:①牙周膜细胞增殖的测定结果:除黄连组外其他各组均明显促进人牙周膜细胞增殖,与对照组比较,差异明显(P<0.05)。双黄补组细胞的吸光度值增大最为明显。随着作用时间的延长,细胞的吸光度值逐渐增大,在第5天达到最大。不同时间各组间比较,差异有显著性意义(P<0.05)。②各组牙周膜细胞胶原蛋白占总蛋白的比值:除黄连组外其他各组均明显促进比值增大,与对照组比较,差异明显(P<0.05)。双黄补组比值增大最为明显。随着作用时间的延长,比值逐渐增大,在第5天达到最大。不同时间各组间比较,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:双黄补水提液可明显促进人牙周膜细胞增殖,明显提高胶原蛋白在总蛋白中的比值,可作为人牙周膜细胞增殖的理想的中药辅助因子。     

脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子单独或联合体外诱导人脐带血来源的间充质干细胞向神经样细胞分化

背景：体外培养条件下脐血间充质干细胞可向神经样细胞诱导分化,一定浓度范围的脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子联合体外诱导可获得较高的神经元分化比例。 目的：观察脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子单独或联合体外诱导人脐带血来源的间充质干细胞分化成神经样细胞的可行性。 方法：取第5代的脐血间充质干细胞,分别用5,10,20 μg/L的脑源性神经营养因子和5,10,20 μg/L睫状神经营养因子单独或联合诱导脐血源间充质干细胞向神经样细胞分化,另设空白对照组无任何干预措施。倒置相差显微镜观察细胞形态变化,于实验第1,3,6天分别进行神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫细胞化学染色,并计数分化为神经元样细胞及神经胶质细胞的比例。 结果与结论：①向神经细胞诱导后,人脐血源间充质干细胞形态明显改变,胞体收缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构。②与空白对照组相比,脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子能显著提高人脐血源间充质干细胞分化为神经元的比例。其中20 μg/L的脑源性神经营养因子联合20 μg/L睫状神经营养因子诱导人脐血源间充质干细胞分化为神经样细胞的比例最高。提示人脐血间充质干细胞经脑源性神经营养因子和睫状神经营养因子体外诱导,均能够分化为神经样细胞。     

人胚嗅鞘细胞与胚胎脊髓组织联合移植对大鼠脊髓损伤的治疗作用

目的探讨人胚嗅鞘细胞（OECS）和大鼠胚胎脊髓组织（ESC）联合移植在促进大鼠横断脊髓轴索再生方面有无协同作用。方法将体外培养纯化的OECS及新鲜获取的胎鼠脊髓组织用作治疗大鼠脊髓半切洞损伤模型的移植物,通过对动物定期进行行为学评定,结合病理学观察,并通过辣根过氧化物酶-四甲基联苯胺（HRP-TMB）逆行示踪技术,评价OECS和ESC对神经元存活、纤维再生的影响。结果OECS和ESC联合移植对损伤脊髓具有明显保护作用并能促进宿主脊髓轴突再生,ESC不能帮助再生轴索返回宿主组织;而OECS除能帮助再生轴索突破胶质屏障外更能使再生轴突髓鞘化,并具有一定的迁移能力。结论OECS和ESC联合移植在促进大鼠脊髓功能恢复中起到了互补和协同的作用。     

体外诱导胎盘来源间充质干细胞分化为神经元样细胞的实验研究

目的:探索体外诱导胎盘间充质干细胞(PMSCs)分化为神经元样细胞的方法。方法:消化胎盘组织,贴壁培养细胞,观测形态并用流式细胞仪检测其细胞表面标志;用含叔丁对甲氧酚(BHA)、二甲基亚砜(DMSO)及碱性成纤维细胞因子(b-FGF)的条件培养基培养细胞,诱导分化为神经元样细胞,采用免疫细胞化学的方法对分化的细胞进行鉴定。结果:胎盘组织的贴壁细胞与骨髓间充质干细胞(BMSCs)有相似形态和细胞表面标志,诱导后细胞表达神经元和星形胶质细胞标志神经元特异性的烯醇化酶(NSE)、和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论:胎盘组织中存在能分化为神经元样细胞的间充质干细胞。     

人脐血间充质干细胞的分离培养与向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨来源于人脐血的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化成神经元样细胞的可行性，以及在体外分离、纯化和扩增的条件。方法 无菌条件下收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血，经肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞，以偏酸性的Mesencult^TM作为培养基进行培养和纯化，获得贴壁细胞，取扩增第三代后的MSCs向神经元样细胞诱导分化。用免疫荧光标记方法检测神经元特异性标记物。结果 来源于脐血的单个核细胞种植于特定的培养基中后，可产生贴壁细胞，主要表现为破骨样和间充质样细胞；传3代后，这些细胞可得到纯化、扩增；免疫组化标记显示经诱导后的MSCs表达神经丝蛋白(NF)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)。结论 源于脐血的MSCs在体外可以培养、扩增，并向神经元样细胞分化，可作为神经干细胞的来源而用于实验研究和临床。     

双黄补对牙周病中牙周膜细胞的增殖分化的调控

目的:探讨中药双黄补对体外培养的人牙周膜细胞(PDLC)增殖和分化的影响。方法:通过体外培养人PDLC,应用双黄补提取液作为辅助因子分成8组:A·黄连;B·黄芩;C·骨碎补;D·黄连加黄岑;E·黄连加骨碎补;F·黄岑加骨碎补;G·黄连、黄芩、骨碎补;H·对照组。采用MTT比色法测定细胞增殖情况,羟脯氨酸法测定胶原蛋白比值。结果:各组药物提取液均有促进PDLC增殖和提高胶原蛋白比值的作用,与对照组比较,差异有显著性,其中以双黄补组的效果最明显。不同孵育时间培养中以第5天的作用最强。结论:双黄补水提液可明显促进人PDLC增殖,明显提高胶原蛋白在总蛋白中的比值,可作为PDLC增殖的理想的辅助因子。     

不同胚龄人神经干细胞的分离和培养

目的 探索不同胚龄人神经干细胞分离和培养的适宜条件。方法 在多种培养条件下，采用无血清培养和单细胞克隆技术，从7周和13周人胚脑中分离和培养神经干细胞，应用免疫荧光染色予以鉴定。结果 从两个不同胚龄的人胚脑中分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，未包被组7周的人胚脑除高密度县浮培养法生长不良，其它密度及培养法均有克隆球形成；13周的人胚脑仅中等密度悬浮培养法及高密度贴壁培养法有克隆球形成；包被组各种密度培养均生长不良。结论 人胚脑中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞，随着胚龄增大，培养难度逐渐加大，高密度贴壁培养法适宜各胚龄神经干细胞的分离培养。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养和向神经细胞分化的研究

目的　分离骨髓后培养人骨髓间充质干细胞 (hMSCs) ,进行体外传代扩增 ,并探索体外诱导分化为神经元样细胞的方法。方法　抽取人骨髓血 ,percoll paque液 (1 0 73g/ml)分离 ,DMEM/2 0 %FCS培养传代 ,至第 3～ 5代时加入巯基乙醇 (BME) ,观察hMSCs分化为神经元样细胞的形态学变化。结果　hMSCs在体外可以实现数目扩增 ,在特定诱导剂的作用下向神经元样细胞分化。结论　采用少量骨髓样本 ,经培养获得充足的细胞量 ,满足定向诱导和细胞移植的需要。     

脐带血间充质干细胞体外分离、纯化及培养

目的　研究脐带血 (HUCB)中含有的间充质干细胞 (MSCs)体外分离、纯化及培养条件 ,探究其作为种子细胞应用于实验和临床的可行性。方法　无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带血 ,经肝素抗凝 ,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞 ,以偏酸性的MesencultTM作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层 ,用流式细胞仪检测MSCs表面抗原。结果　来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞 ,间充质细胞为成纤维样的细胞形态 ,并表达MSCs相关的抗原 (CD2 9、CD4 4、CD1 6 6 ) ,但不表达造血细胞抗原 (CD34 、CD4 5) ,这与源于骨髓的MSCs一致。结论　脐带血来源的MSCs能在体外培养、扩增 ,而用于满足实验和临床的需要