携带mda7/IL24的三调控增殖腺病毒治疗肝癌的体外实验

目的：构建缺失E1A区24bp，由端粒酶反转录酶基因启动子和缺氧基因启动子调控的增殖腺病毒SG600-IL24，研究人白细胞介素24（interleukin 24，IL24）在肝癌细胞内的表达水平和SG600-IL24的增殖情况及其对肝癌细胞的杀伤作用。方法：利用DNA克隆和重组技术，构建SG600-IL24。ELISA检测IL24在肝癌细胞SMMC-7721、BEL4404和正常成纤维细胞BJ内的表达。半数组织培养感染剂量（50％ tissue culture infectious dose，TCID50）法检测SG600-IL24在3种细胞内48和96h的增殖情况。MTT法和细胞病理效应（cytopathic effect，CPE）染色法检测SG600-IL24在不同MOI值对3种细胞的杀伤作用。结果：IL24在SMMC-7721和BEL-7404细胞内高表达而在BJ细胞内低表达。感染48和96h后，SG600-IL24在SMMC-7721、BEL-7404和BJ细胞内分别增殖794和7940倍、622和7810倍、20和200倍。MTT结果显示，杀伤50％和90％的SMMC-7721、BEL-7404和BJ细胞所需SG600-IL24的MOI值分别为0．3和5，3和20，50和150。CPE染色显示，SG600-IL24对肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7404有明显杀伤作用，而对BJ细胞无明显影响，并且该病毒的杀伤能力比增殖腺病毒ZD55-IL24和非增殖腺病毒Ad-IL24强。结论：SG600-IL24高效感染肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7404后，病毒增殖活跃，IL24的表达量显著升高。SG600-IL24对此2种肝癌细胞有良好的特异性杀伤作用，而对正常细胞没有明显影响，为应用该病毒治疗肝癌的体内研究建立了基础。     

转移抑制基因nm23—H1蛋白表达与结直肠癌的关系

目的：研究转移抑制基因nm23-H1蛋白表达与结直肠癌生物学行为的关系,探讨nm23-H1基因表达在结直肠癌发生发展中的作用。方法：采用免疫组化技术,对46例结直肠癌组织中nm23-H1基因的表达状态进行定位观察。结果：结直肠癌nm23-H1基因蛋白阳性表达率为43．5％;nm23-H1基因的表达与结直肠癌的分化程度及肿块大小无显著性差异（P＞0．05）,但与结直肠癌的淋巴结转移,临床分期以及侵犯深度有相关差异（P＜0．05）;随着转移的发生,侵犯深度的增加以及疾病向晚期发展,nm23-H1基因的阳性表达率逐渐下降,直至完全失活。结论：作为肿瘤转移抑制基因,nm23-H1基因在调控癌细胞增殖,抑制癌细胞转移方面起着重要的作用;nm23-H1蛋白可作为临床判断结直肠癌侵袭转移,临床分期和患者预后的指标之一。     

肾癌细胞凋亡的超微结构改变

目的 观察肾癌细胞凋亡的形态学特征及凋亡过程中线粒体结构的变化,揭示线粒体在细胞凋亡过程中的作用。方法 采用3种化疗药物诱导肾癌细胞发生凋亡,再于光镜和电镜下观察肾癌细胞的形态结构改变。结果 3种药物均可诱导肾癌细胞凋亡,有典型的细胞凋亡的形态学改变,线粒体结构改变早于细胞染色质结构改变。结论 线粒体在细胞凋亡的过程中起着重要的调控作用,其内部某些成分可能启动或阻止细胞凋亡的发生。     

双靶向溶瘤腺病毒携带内皮抑素基因对肝癌的抑制作用

目的 构建双调控溶瘤腺病毒,携带小鼠内皮抑素基因(mE),研究其对裸鼠肝癌移植瘤的抗瘤活性.方法 以人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)和缺氧调控元件序列(HRE)调控腺病毒E1a和E1b基因,基因组插入mE基因,构建双调控溶瘤腺病毒CNHK500-mE;在裸鼠模型中观察CNHK500-mE对肝癌移植瘤模型的疗效.结果 CNHK500能够在hTERT阳性的肝癌细胞中增殖[24 h:(16.67±4.04)％;48 h:(65.33 ±7.02)％;P＜0.01],并介导mE高效表达;与空白对照组( 1895.80±323.37) mm3比较,CNHK500-mE和Ad-mE的抑瘤率分别为50.95％[(929.80±211.10) mm3,P＜0.01]和29.99％[(1327.23 ±319.36) mm3,p＜0.05];CNHK500-mE对癌组织间质血管的抑制作用明显强于Ad -mE(P ＜0.05).结论 将mE与溶瘤腺病毒结合,发挥病毒增殖的溶瘤作用和基因产物的血管抑制作用,表现出明显的协同抗瘤作用.     

miRNA-145抑制肺癌细胞系A549迁移侵袭的研究

摘 要：［目的］ 观察miRNA-145对肺癌细胞系A549迁移、侵袭和克隆形成的影响,探讨其潜在的应用价值。［方法］ 采用miRNA-145过表达的慢病毒载体上调A549细胞中miRNA-145的表达量,Transwell迁移及侵袭实验分析miRNA-145表达上调前后A549细胞的体外迁移、侵袭能力,平板克隆形成实验分析miRNA-145表达上调前后A549细胞的体外增殖能力。［结果］ RT-PCR结果表明,侵染了miRNA-145过表达载体的A549细胞中miRNA-145水平明显高于阴性对照组及空白对照组,差异有统计学意义（P<0.01）;Transwell迁移和侵袭实验结果表明,过表达miRNA-145的A549细胞过膜数少于阴性对照及空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01);平板克隆形成实验结果表明,过表达miRNA-145的A549细胞平板克隆形成能力明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。［结论］ miRNA-145的过表达能够抑制肺癌细胞系A549的迁移、侵袭和克隆形成,由此提示miRNA-145有可能成为肺癌治疗的潜在靶点。     

胃癌细胞骨架和细胞外基质与癌细胞浸润转移的关系

胃癌细胞骨架和细胞外基质与癌细胞浸润转移的关系苏长青，徐随福细胞骨架（ＣＳ）和细胞外基质（ＥＣＭ）相互作用和影响，具有维持细胞形态，调节细胞运动和分化生长，参与细胞信息传递等功能。我们应用免疫组化和免疫电镜技术，对正常胃粘膜、胃癌组织的ＣＳ和ＥＣＭ作...     

胃癌细胞免疫表型特征与器官转移的相关性

胃癌细胞免疫表型特征与器官转移的相关性苏长青张燕癌细胞最重要的生物学特性就是侵袭转移，我们通过对胃癌转移特征的研究，试图揭示癌细胞免疫表型与器官转移特异性之间的关系。一、材料与方法２５８例手术切除的胃癌标本，经临床病理诊断，发现有淋巴结转移者２０９例...     

鞘内注射人β-内啡肽基因重组腺病毒对慢性神经病理痛大鼠的镇痛作用

目的观察鞘内注射入β-内啡肽(β-EP)基因重组腺病毒(Ad-NEP)对慢性神经病理痛大鼠的镇痛作用。方法36只雄性SD大鼠,体重210-260 g,随机分为手术组(n=26)、假手术组(n= 5)、空白对照组(n=5),手术组分为三个亚组:Ad-NEP组(n=9)、绿色荧光蛋白基因重组腺病毒(Ad- GFP)组(n=9)、生理盐水组(n=8)。大鼠腹腔注射氯胺酮100 mg/kg和阿托品50 mg/kg麻醉后,手术组构建大鼠坐骨神经慢性捆扎(CCI)模型,假手术组进行同样手术,但不捆扎坐骨神经,空白对照组不进行手术;手术组经L5,6间隙蛛网膜下腔置入PE-10导管,7d后分别注射1×108pfu的Ad-NEP、Ad- GFP和40μl生理盐水。于手术后7 d(T0)、鞘内注射前当日(T1)、注射后1 d(T2)、1周(T3)、2周(T4)、3 周(T5)、4周(T6)、5周(T7)分别测定五组大鼠的左右足热痛阈;T3时取Ad-NEP、Ad-GFP组大鼠各1 只,取脊髓L3-6段作免疫组化检测;鞘内注射后10 d取Ad-NEP、Ad-GFP组大鼠,经腹腔内注射1 mg/kg 纳络酮,每间隔10min记录右足热痛阈(t0-9,共观察90min),并分别测定这两组T1-7时的脑脊液内β- EP浓度。结果Ad-GFP组和生理盐水组大鼠右足热痛阈明显低于假手术组和空白对照组(P< 0.01)。Ad-NEP组在T0,1,7时右足热痛阈明显低于假手术组和空白对照组(P<0.01),在T2-6时的右足热痛阈高于T0,也高于Ad-GFP组和生理盐水组(P<0.05或0.01),t1-6时右足热痛阈低于t0时(P< 0.01),与Ad-GFP组和生理盐水组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Ad-NEP组脊髓外膜可见明显的橙黄色浓染带,后角区可见少量橙黄色细胞,T2-7时脑脊液内β-EP浓度均高于Ad-GFP组(P< 0.01。)结论鞘内注射重组腺病毒Ad-NEP对慢性神经病理痛大鼠有明显的镇痛效果,作用时间长达4周以上。     

基因-病毒治疗系统CNHK200-hA的构建及体外初步研究

目的　构建一种结合抗肿瘤新生血管生成的基因治疗与病毒治疗优势的新型肿瘤基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA。方法　克隆人抗血管生成基因Angiostatin(k1 5 ) ,命名为hA。利用病毒重组技术将hA插入肿瘤特异性增殖病毒的病毒基因组中 ,通过病毒增殖试验、电镜技术、Westernblot分析、鸡胚尿囊膜试验 (CAM ) ,观察CNHK2 0 0 hA的复制情况、hA基因的表达及其对新生血管生成的抑制作用。结果　构建了一种新型的基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA。该治疗系统为E1b 5 5× 10 3 蛋白缺失而保留了腺病毒E1a蛋白的 5型腺病毒 ,能在肿瘤细胞内大量增殖及复制 ,而在正常细胞内增殖能力较弱 ,从而特异性杀灭肿瘤细胞。同时CNHK 2 0 0 hA携带人抗肿瘤新生血管生成基因hA ,能在肿瘤细胞内高效表达hA蛋白 ,其表达量高于传统基因治疗的腺病毒载体系统。电镜证实该治疗系统可在肺癌A5 49细胞株中复制及增殖。CAM试验证实该治疗系统感染肺癌细胞后的培养液上清具有抗新生血管生成的生物活性。结论　基因 病毒治疗系统CNHK2 0 0 hA能在肿瘤细胞中增殖复制 ,并明显提高hA基因的表达量 ,表达产物具有抑制新生血管形成的作用。     

基因-病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin的构建及体外研究

目的构建一种新型的肿瘤基因．病毒治疗系统CNHK300-murine endostatin（CNHK300-mE），以肿瘤增殖病毒为载体，携带抗肿瘤新生血管生成的基因。方法利用基因重组技术将人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子插入腺病毒E1A基因上游，将小鼠内皮抑素基因表达盒插入到腺病毒包装信号和hTERT启动子之间，通过病毒增殖试验、电镜技术、Western blot分析、酶联免疫吸附实验（ELISA）、鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）试验，观察CNHK300-mE的复制情况、mE的表达情况及对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制情况。结果成功构建了基因-病毒治疗系统CNHK300-mE，该系统为hTERT启动子调控腺病毒E1A基因表达并携带小鼠内皮抑素基因的重组腺病毒。该病毒可以在端粒酶阳性的胃癌细胞株SGC-7901和肝癌细胞株HepGⅡ中大量增殖及复制，而在端粒酶阴性的正常纤维细胞中不增殖。电镜证实该重组病毒在胃癌细胞株SGC-7901中复制及增殖。ELISA检测表明SGC-7901感染CNHK300-mE后7d，小鼠内皮抑素的表达量为1000μg／L。CAM实验证实该病毒感染胃癌细胞后的培养液上清具有抗新生血管生成的生物活性。结论基因-病毒治疗系统CNHK300-mE能在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性增殖复制，并大量表达具有抗新生血管生成生物活性的小鼠内皮抑素。