MDA-7基因的腺病毒载体构建及对肿瘤细胞凋亡的影响

目的:构建一种端粒酶启动子调控目的基因MDA-7/hIL24表达的复制缺陷型腺病毒,并初步探索其抗肿瘤活性。方法:通过基因操作技术将启动子(hTERTp) 目的基因(MDA-7)插入到5型腺病毒E1A区域,构建复制缺陷型腺病毒AdTP-mda7;同时构建对照病毒AdTP-EGFP。TCID50法测定病毒滴度。应用蛋白质印迹法检测MDA-7在肿瘤细胞株中的表达状态;通过结晶紫染色实验检测两种病毒对肿瘤细胞的杀伤差异。结果:成功构建携带目的基因的腺病毒载体,PCR鉴定正确;蛋白质印迹结果表明MDA-7选择性地在多种肿瘤细胞株中表达,诱导肿瘤细胞凋亡,如A549,SGC-7901等,在以相同MOI值感染原代成纤维细胞时,原代细胞中没有检测到MDA-7表达;结晶紫染色试验结果表明AdTP-mda7对肿瘤细胞株的杀伤能力明显高于对照病毒AdTP-EGFP。结论:成功构建复制缺陷型腺病毒AdTP-mda7,并证实MDA-7蛋白在肿瘤细胞中过表达诱导多种肿瘤细胞株发生凋亡。     

腺病毒载体介导的可调控鼠白细胞介素12基因对大肠癌小鼠的治疗效果

目的 构建携带鼠白细胞介素(mIL)12基因并可经RU486诱导表达的重组腺病毒载体,研究其对小鼠大肠癌移植瘤的治疗效果及安全性.方法 将穿梭质粒pDC-RUmIL-12与Admax腺病毒包装系统的辅助质粒pBHGloxΔE1,3Cre共转染HEK293细胞后,构建出可调控的复制缺陷性重组腺病毒载体,用mIL-12引物对病毒进行鉴定;氯化铯密度梯度离心纯化病毒,最终稀释法测定其滴度.体外感染结肠癌C26细胞后,用ELISA法检测其基因调控表达.皮下注射C26大肠癌细胞构建小鼠大肠癌动物模型,将60只小鼠分成4个治疗组(Ad-缓冲液对照组、Ad-RUmIL-12对照组、Ad-RUmIL-12+RU486治疗组和Ad-mIL-12治疗组), 从各治疗组的肿瘤大小、病理及血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平等方面评价各组的治疗效果及不良反应.结果 经PCR鉴定证实可调控腺病毒载体Ad-RUmIL-12构建正确,纯化后病毒滴度达到4.62×1010空斑形成单位(pfu)/ml.病毒感染体外培养的C26细胞后,给予诱导剂RU486则最高可诱导表达mIL-12蛋白(516 ±43)pg/ml,而去除和不加入RU486时,只有少量的mIL-12蛋白表达[(38±3)pg/ml、(42±5)pg/ml].在小鼠动物模型上, Ad-RUmIL-12治疗组和Ad-缓冲液组肿瘤生长较快;Ad-RUmIL-12+RU486 治疗组和Ad-mIL-12治疗组对肿瘤生长有明显的抑制作用,病理检查显示两组肿瘤有较明显的坏死,而前组小鼠的血清ALT水平和不良反应发生率明显低于后组(4/15比10/15,P<0.05).结论 成功构建了可调控重组腺病毒 Ad-RUmIL-12,可以通过RU486诱导mIL-12蛋白的表达,并对大肠癌移植瘤有杀伤作用,明显提高了肿瘤基因治疗的安全性.     

细胞凋亡的形态代谢特点及生物学意义

细胞凋亡的形态代谢特点及生物学意义苏长青综述龚西审校细胞凋亡（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）的概念最早由Ｋｅｒｒ等［１］于１９７２年提出，亦称细胞程序性死亡（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ）。长期以来，有关细胞凋亡的发生机制及生物学意义一直未受重视。近...     

腺病毒E1a基因增强P16基因诱导SMMC-7721肝癌细胞的凋亡

目的:研究腺病毒E1a基因与P16抑癌基因协同对肝癌SMMC-7721细胞凋亡和增殖的影响,探索肿瘤基因治疗新模式.方法:构建E1a基因真核表达质粒pDC315-E1a和携带P16的重组病毒AdCMV-P16,RT-PCR和免疫荧光标记法检测pDC315-E1a质粒转染或AdCMV-P16病毒感染后SMMC-7721细...     

hSulf-1过表达提高乳腺癌MCF-7细胞对PARP抑制剂AZD2281的敏感性

探讨人硫酸酯酶-1（human sulfatase 1,hSulf-1）基因过表达是否提高乳腺癌MCF-7细胞对PARP抑制剂AZD2281的敏感性。方法：采用不同浓度AZD2281处理细胞,并筛选AZD2281处理的最佳浓度。将携hSulf-1基因的重组腺病毒Ad5-hSulf1感染MCF-7细胞,以Ad-hSulf1和AZD2281单独或联合处理MCF-7细胞,以Ad5-EGFP处理为对照。采用流式细胞术检测细胞周期,克隆形成实验检测细胞克隆形成率,Western blotting检测细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin dependent kinase 4,CDK4）及磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B,p-AKT）的表达,Transwell法、MTT法分别检测细胞的迁移及增殖。结果：AZD2281浓度为7 μmol/L时对MCF-7细胞的抑制作用趋于峰值,用于后续实验。Ad5-hSulf1+AZD2281联合处理与AZD2281单独处理相比,MCF-7细胞的G2/M期细胞比例明显增多[（22.15±0.17）% vs（17.44±0.57）%,P<001],细胞克隆形成率[（21.43±1.52）% vs（49.43±1.44）%,P<0.01]及细胞周期蛋白CDK4的表达[（0.67±0.02）vs（0.72±0.02）,P<0.05]、AKT的磷酸化水平[（0.17±0.003）vs（0.42±0.02）,P<0.01]均明显降低,同时细胞的增殖率和迁移能力也有明显下降[（57.69±4.83）% vs（79.35±5.44）%;（10.33±1.53）个vs（50.67±2.31）个,均P<0.01]。结论：hSulf-1过表达可明显提高乳腺癌细胞MCF-7对AZD2281的化疗敏感性,阻滞细胞周期于G2/M期,并更明显地抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力,这一效应可能是通过调节细胞周期蛋白CDK4及AKT通路产生的。     

原位分子杂交电镜技术在胃癌细胞角蛋白mRNA定位中的应用

原位分子杂交电镜技术在胃癌细胞角蛋白ｍＲＮＡ定位中的应用苏长青，曹祥荣，乐美兆，宋小明（解放军八一医院电镜室南京２１０００２南京师范大学生物系）随着原位分子杂交技术在组织学、病理学、遗传学等学科的应用，国内外已有人开始尝试进行超微结构水平的原位分子杂...     

皮肤麦克细胞癌的临床病理特征（附4例报告及文献复习）

对4例皮肤麦克细胞癌进行了临床病理分析，结合文献复习，认为该肿瘤好发于中老年女性，好发部位为身体暴露部位的皮肤，高度恶性，局部复发率和区域淋巴结转移率高。肿瘤形态学和免疫标记特征与其它神经内分泌肿瘤相同，但同时又具有多向分化的表型特征。本文对其组织起源进行了初步探讨。     

腺病毒载体携带全长人乙肝病毒表面前S2蛋白抗体基因在体外的表达

目的　构建携带全长人乙肝病毒表面PRES2 蛋白抗体基因的腺病毒载体 ,观察其在体外的表达。方法　将全长 2 5 70bp人乙肝病毒表面PRES2 蛋白抗体基因克隆入 5型腺病毒穿梭质粒载体 ,在 2 93细胞中重组产生重组腺病毒 ,体外感染CHO细胞 ,感染复数 (MultiplicityofInfec tionVirus/Cell)为 2 0 ,获得表达产物 ,并测定其亲和力。结果　TCID5 0法测定重组腺病毒滴度为(2 .1× 10 10 )pfu/ml。病毒感染CHO细胞后 ,表达蛋白经蛋白质印迹分析证实为全长人源化抗体。抗体亲和力常数为 (2 .16± 0 .2 0 )× 10 8L/mol。结论　全长人乙肝病毒表面PRES2 蛋白抗体基因腺病毒载体成功构建和表达全长高亲和力人源化抗体 ,为乙型肝炎治疗提供了一个全新的途径。