PCR技术的新发展及新用途

ＰＣＲ技术的新发展及新用途（２１０００２）南京八一医院肿瘤中心电镜室苏长青综述乐美兆审校ＰＣＲ技术的发明，是分子生物学领域的一项里程碑，自问世以来就立即得到普遍重视。基于ＰＣＲ是模拟天然ＤＮＡ复制过程而设计的特异ＤＮＡ序列体外扩增方法，许多研究人员充...     

肿瘤转移抑制基因nm23H1 mRNA在人非小细胞肺癌中的表达

nm23H1是癌转移抑制基因,位于人17号染色体长臂(17q21)[1],其产物为相对分子质量1.7万的核苷二磷酸激酶(NDPK),该基因表达水平与肺癌转移扩散及预后的关系尚无定论。我们应用原位杂交技术对nm23H1mRNA在肺癌组织中的表达进行分析,以探讨其与临床病理的关系。1　材料和方法...     

人硫酸酯酶１基因的作用机制及抗瘤活性

人硫酸酯酶１（ｈＳｕｌｆ-１）能够使细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（ＨＳＰＧｓ）脱硫酸化，从而抑制下游肝素结合生长因子信号途径的激活。人恶性肿瘤中ｈＳｕｌｆ-１常处于失活状态，转染外源性ｈＳｕｌｆ １能够抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭，因此ｈＳｕｌｆ-１是肿瘤基因治疗的一个很有潜力的靶点。     

p16和Rb基因蛋白在肺癌中的表达

目的：研究ｐ１６和Ｒｂ基因蛋白的表达与肺癌临床病理学特征的关系。方法：采用免疫组织化学方法对８９例肺癌进行了ｐ１６和Ｒｂ蛋白的定位观察。结果：肺癌；ｐ１６基因蛋白的总丢失率为４７．２％，且与肺癌的组织学类型，淋巴结转移，临床病理分期有关。Ｒｂ基因蛋白的总丢失率为３１．５％，与组织学类型有关。     

以端粒酶为靶点的肿瘤诊断与基因治疗策略

细胞获得永生化,具有了无限增殖的能力,主要依赖于细胞内端粒酶的激活。自1994年Kim等[1]创立了端粒酶活性检测的端粒重复聚合酶链反应(TRAP鄄PCR)方法及在肿瘤组织中发现端粒酶活性以来,端粒酶已成为生命科学领域里研究热点。大量研究表明,各种类型的恶性肿瘤中都有不同程度地表达端粒酶的活性[2]。由于肿瘤诊断和治疗最理想的靶点就是找到一种肿瘤细胞所具有、在正常细胞中不存在的物质基础,而端粒酶在肿瘤细胞中的激活并维持细胞的无限增殖能力,是恶性肿瘤细胞区别于正常细胞的重要特征之一,具备了作为肿瘤诊断和治疗物质基础的条件…     

多重调控病毒.基因载体的构建及其体外抗肿瘤活性

目的 构建一种新型的病毒.基因治疗载体.方法 通过克隆技术将人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因插入质粒载体pBHGE3的E3区,得到由主要晚期启动子(MLP)调控的腺病毒质粒pPE3-hTRAIL,再通过与质粒pSGS00在293细胞中进行位点特异性重组得到E1A、E1B基因分别受hTERT启动子与HRE启动子双重调控的重组增殖型腺病毒,用TCID50方法测定病毒滴度.通过增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力.利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测人TRAIL基因的表达.并进行噻唑蓝(MTT)比色法实验检测其杀伤肿瘤细胞的能力.结果 CNHK500-hTRAIL的病毒滴度为2.39×1010pfu/ml,增殖实验结果证实CNHK500-hTRAIL可以选择性地在端粒酶阳性的人肺癌细胞A549中增殖,其所携带的人TRAIL基因在A549中的表达量(183.12μg/L)明显高于携带该基因的非增殖型腺病毒载体Ad-hTRAIL(24.53μg/L,P<0.01).MTr显示CNHK500-hTRAIL对A549的杀伤能力明显高于携带该基因的非增殖型腺病毒载体Ad-hTRAIL,其半数抑制MOI值分别为17.825、0.197(P<0.01).结论 CNHKS00一hTRAIL是一种具备治疗肺癌潜力的新型病毒-基因治疗系统.     

肺癌组织中Ⅰ型胶原纤维mRNA的原位杂交观察

目的：讨论Ⅰ型胶原纤维的增生与肺癌发生发展的关系。方法：采用基因原位杂交的方法对４０例肺癌和正常肺组织中Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ的表达进行了研究。结果：肺癌组织中Ⅰ型胶原纤维的合成明显强于肺组织。Ⅰ型胶原ｍＲＮＡ阳性的成纤维细胞分布于癌巢周边和癌巢内。结论：Ⅰ型胶原纤维的增生在肺癌的发生发展中起一定作用。     

重组腺病毒载体转染p16基因对肝癌细胞的生长抑制作用

目的：通过腺病毒转染p16基因观察对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤作用。方法：克隆人p16基因全长cDNA序列，构建携带p16基因的增殖缺陷型重组腺病毒p16(AdV-p16)，以AdV-p16感染人肝癌SMMC-7721细胞，观察p16基因的表达及其对细胞的生长抑制或杀伤作用。结果：AdV．p16能介导外源基因p16在肝癌SMMC-7721细胞系中高效表达。在感染AdV-p16后随重复感染度(MOI)升高p16基因阳性表达率升高，四甲基偶氮唑蓝染色法(MTT)实验结果表明，SMMC-7721细胞的生长受抑制。结论：腺病毒能够介导p16基因在肝癌细胞中高效表达，促进细胞周期阻滞和诱导肿瘤细胞凋亡。     

新型的病毒-基因治疗系统CNHK500-hγ的构建

目的研制出一种新的基因-病毒治疗系统。方法通过基因操作技术将主要晚期启动子(MLP)调控的人干扰素-γ基因插入腺病毒E1A基因受hTERT启动子调控、E1B基因受HRE启动子调控的增殖病毒载体质粒PXC70-HRE-TP的E1A上游,得到腺病毒质粒pSG500-hγ。通过pSG500-hγ与质粒pBHGE3在293细胞中同源重组得到重组病毒CNHK500-hγ。用TCID50方法测定病毒滴度。通过增殖实验观察重组病毒的选择性增殖能力。利用ELISA法检测人干扰素-γ抗癌基因的表达。结果CNHK500-hγ的病毒滴度为4×109pfu/ml,增殖实验结果证实CNHK500-hγ可以选择性地在端粒酶阳性的肝癌细胞中增殖,CNHK500-hγ所携带的人干扰素-γ基因在肝癌细胞株中的表达量(442μg/L)明显高于携带该基因的非增殖型腺病毒载体(120μg/L)Ad-hγ(P<0.005)。结论CNHK500-hγ是一种具备治疗肝癌潜力的新型基因-病毒治疗系统。     

携带mIFN-γ的溶瘤病毒CNHK300-mIFN-γ对肿瘤细胞的体外杀伤作用

目的: 研究携带小鼠干扰素γ(mIFN-γ)基因的溶瘤病毒CNHK300-mIFN-γ(CNHK300-Mγ)对恶性肿瘤细胞的体外杀伤作用。方法: CNHK300-Mγ、CNHK300、ONYX-015和AdEasy-mIFN-γ(AdEasy-Mγ)感染肺癌细胞株A549、肝癌细胞株SMMC-7721、胰腺癌细胞株PANC-1和正常成纤维细胞株BJ,通过病毒增殖实验、细胞病理效应和细胞杀伤实验观察CNHK300-Mγ、CNHK300和ONYX-015在上述肿瘤细胞和正常细胞中的增殖能力和对这些细胞的杀伤作用,通过双抗体夹心ELISA检测CNHK300-Mγ和AdEasy -Mγ在上述肿瘤细胞和正常细胞中不同时相的mIFN-γ表达量。结果: CNHK300-Mγ具有类似于CNHK300的肿瘤细胞选择增殖性,能在恶性肿瘤细胞中大量增殖并杀灭肿瘤细胞,均强于ONYX-015(P<0.01),而在正常细胞中增殖和杀伤作用均较弱,弱于ONYX-015(P<0.05)。CNHK300-Mγ感染恶性肿瘤细胞后有大量的mIFN-γ表达,并随着感染时间延长表达量也相应上升,而AdEasy-Mγ感染后只有少量mIFN-γ的表达,而且感染的时间延长表达量变化也不大(P<0.01)。结论: CNHK300-Mγ能选择性地在肿瘤细胞中增殖,并杀灭肿瘤细胞,同时大量表达具有抗肿瘤作用的蛋白,发挥多重抗瘤作用,有良好的临床应用前景。