阿尔茨海默病基因治疗实验研究进展

阿尔茨海默病(AD)主要症状为进行性记忆力和认知力减退.目前,药物治疗仍是治疗AD的主要手段,但现在所开发的药剂多为化学合成药,药物作用位点不专一,特异性弱.相反,采用基因治疗的方法不仅定位准确,作用持续时间长,而且没有非靶器官的副作用,是一种较为理想的治疗方法.此外,虽然研究证实AD是一种多病因介导的疾病,但是脑内β淀粉样蛋白(Aβ)代谢异常造成的Aβ片段聚集沉积引发的级联反应是AD的主要致病原因.Aβ的稳态水平依赖于生成、清除和内流间的平衡,因此,若能通过基因治疗的手段减少Aβ生成或上调酶介导的Aβ降解,促进受体介导的Aβ脑外流,抑制Aβ脑内流,便可有效地治疗AD.     

负载酸洗脱食管癌抗原肽的脐血树突状细胞对CTL杀伤活性的影响

分离脐血中的单个核细胞,以酸洗脱食管癌抗原肽负载获得分化成熟树突状细胞（DCs）,检测其对特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）的诱导和体外杀伤效应的影响。结果发现,负载食管癌抗原肽的脐血DCs诱导的CTL对酸洗前食管癌细胞株T.Tn的杀伤率显著高于酸洗后组和各对照组（P均〈0．05）,而对无关肿瘤细胞株Hep2无显著杀伤作用。认为负载食管癌抗原肽的脐血DCs体外可诱导CTL产生特异性杀伤效应。     

Tα1对食管癌细胞RNA转染的脐血树突状细胞诱导T细胞杀瘤活性的影响

目的:探讨食管癌细胞RNA转染脐血树突状细胞(dendritic cells.DCs)对T细胞增殖和CTL特异性抗肿瘤作用的影响,以及Tα1对脐血DCs疫苗的免疫佐剂作用.方法:分离脐血单个核细胞,经rhSCF、rhGM-CSF和rhlL-4诱导和T.Tn细胞RNA转染形成成熟DCs,加入Tα1制备肿瘤疫苗.流式细胞术(FCM)检测各组DCs表型变化;MTT法检测各组脐血DCs诱导T细胞增殖和CTL细胞毒活性.结果:T.Tn细胞RNA转染后组较转染前组脐血DCs高表达MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、CD54、CD80和CD86分子(MHC-Ⅰ:70-36±6.09 VS8.17±1.93;MHC-Ⅱ:72.03±5.32 VS 7.64±5.33;CD54:69.36±7.33 VS 2.05±2.03;CD80:67.21±6.77 VS 2.33±1.65;CD86:68.85±7.41VS 6.73±1.97,P＜0.01);与转染前组相比,可显著促进T细胞增殖(10:1:4.77±0.79 V5 1.65±0.71;50:1:3.85±0.57 VS 1.56±0.13;100:1:2.89±0.59 VS 1.19±0.21,P＜O.05),并有效诱导CTL的特异性杀瘤活性(10:1:27.36±8.93VS 10.35±2.93;20:1:44.55±2.36 VS 11.77±1.03;50:1:51.08±4.92 VS 12.75±1.49,P＜0.05).而Tα1能显著促进RNA致敏脐血DCs的各种表面分子表达(MHC-Ⅰ:87.88±9.13VS 70.36±6.09;MHC-Ⅱ:93.16±3.34 VS 72.03±5.32;CD54:91.75±3.84 VS 69.36±7.33;CD80:87.27±8.68 VS 67.21±6.77;CD86:89.09±6.86 VS 68.85 7.41,P＜0.05);和刺激T细胞增殖能力(10:1:8.31±1.78 VS 4.77±0.79;50:1:5.97±0.14 V5 3.85±0.57;100:1:4.03±0.13 VS 2.89±0.59,P＜0.05);及诱导CTL的能力(10:1:47.66±4.12 VS 27.36±8.93;20:1:56.72±7.24 VS 44.55±2.36;50:1:76.48±3.47 VS 51.08±4.92,P＜0.05).结论:Tα1联合食管癌细胞RNA转染脐力DCs可制备高效、特异的肿瘤疫苗,有望成为食管癌生物治疗的新途径.     

用血清药理学方法观察中药复方制剂诱导人胃癌细胞凋亡的研究

采用血清药理学方法，流式细胞仪、琼脂糖胶电泳和透射电镜分析技术对中药复方制剂诱导人胃癌细胞凋亡情况进行检测和观察。结果可见中药复方Ⅰ号诱发肿瘤细胞，ＤＮＡ裂解成典型的梯状电泳图谱，胞核固缩，核染色质着力并裂解为碎块；Ｇ０／Ｇ１期细胞减少，产生典型凋亡峰，提示复方１号对胃癌是一种有潜力的治疗药物。     

用血清药理学方法观察中药复方制剂诱导人胃癌细胞凋亡的研究

采用血清药理学方法，流式细胞仪、琼脂糖凝胶电泳和透射电镜分析技术对中药复方制剂诱导人胃癌细胞凋亡情况进行检测和观察。结果可见；中药复方1号诱发肿瘤细胞，DNA裂解成典型的梯状电泳图谱，胞核团结，核染色质看边并裂解为碎块；G0／G1期细胞减少，产生典型凋亡峰。提示复方1号对胃癌是一种有潜力的治疗药物。     

树突状细胞电转染的优化条件及影响因素

目的 探讨树突状细胞(DC)电转染的方法、优化条件以及影响DC电转染率和存活率的主要因素.方法 提取人肝癌细胞(Bel 7402) RNA,利用淋巴细胞分离液密度梯度法分离人外周血单个核细胞(PBMC),并通过贴壁法获取单核细胞作为树突状细胞前体(pDC).将pDC置含rhGM-CSF和rIL-4的RPMI-1640培养液内联合培养诱导7d,使之充分分化为未成熟的DC (imDC).应用电穿孔仪(electroporation apparatus)分别将人肝癌细胞总RNA和绿色荧光蛋白(GFP)电转染至imDC,并设定不同的电压、脉冲时间、细胞浓度、温度和电转染缓冲液等条件.荧光镜下和光镜下分别计算绿色荧光阳性细胞数和总细胞数.电转染1d后,用0.4%锥虫蓝染色分别计算其电转染率和存活率.结果 当imDC浓度为5×106/ml与40μg的人肝癌细胞总RNA混合,设定电转染仪电压为300V、脉冲时间为500μs时,其电转染率达到最高值,imDC存活率约49.07%.结论 电转染提供了一种使人肝癌细胞RNA电转染至imDC的可行技术.影响imDC电转染率的最主要因素是受体细胞imDC的生长状况、电转染的电压及脉冲时间.     

黄芪提取物对老年痴呆大鼠海马区COX-2和iNOS表达的影响

目的 研究黄芪提取物对老年性痴呆(AD)大鼠学习记忆能力的影响及其作用机制。 方法 SD大鼠海马内注射Aβ25-35制备AD大鼠模型,实验分5组:正常对照组、模型组和不同浓度的黄芪组（20、40 和80 mg/kg）。黄芪组在造模前后均用黄芪提取物灌胃。用Morris水迷宫测定各组大鼠的学习记忆能力,Western blot测定各组大鼠海马COX-2和iNOS蛋白表达。 结果 模型组的逃避潜伏期延长,单位时间内跨越原平台次数减少,海马COX-2和iNOS的表达水平升高,与正常对照组比较均有统计学差异(P＜0.05);不同浓度黄芪组的逃避潜伏期均缩短,单位时间内跨越原平台次数均增多,且呈剂量依赖性;COX-2和iNOS表达水平均下降,并且随着黄芪浓度的增加COX-2和iNOS表达水平降低越明显,与模型组比较差异均有统计学意义 (P＜0.05)。 结论 经过黄芪提取物的治疗,老年痴呆大鼠的学习记忆能力得到了明显提高,其机制可能是黄芪提取物通过抑制COX-2、iNOS等信号转导途径,减轻Aβ25-35毒性作用。     

枸杞多糖对人外周血淋巴细胞免疫调节功能的影响

目的:研究枸杞多糖(lycium bararum polysaccharides,LBPs)对正常人外周血淋巴细胞免疫调节功能的影响.方法:无菌分离人外周血淋巴细胞,加入植物凝集素(PHA)和不同质量浓度的LBPs,MTT法检测其对淋巴细胞增殖的影响:RT-PCR法检测LBP对γ-干扰素(INF-γ)mRNA表达的影响;ELISA法检测LBPs作用后淋巴细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-2(IL-2)分泌的变化.结果:50～100 μg/mL LBPs能明显增强PHA活化的人外周血淋巴细胞的增殖(P＜0.01);80、100 μg/mL的LBPs能使淋巴细胞IFN-γ mRNA的表达水平明显升高(P＜0.01);LBPs能促进淋巴细胞产生IL-2和TNF-α,并呈现浓度依赖性(P＜0.01).结论:LBPs能增强人外周血淋巴细胞的免疫功能从而加强抗肿瘤作用.     

腺相关病毒载体介导的人类HIF-1α基因对海马神经细胞凋亡的影响

目的构建人类缺氧诱导因子-1α(human hypoxia inducible factor,HIF-1α)的腺病毒相关载体(rAAV-HIF-1α),并观察其对β-淀粉样蛋白25-35(Aβ25-35)诱导原代培养海马神经细胞凋亡及细胞内游离钙离子浓度的影响。方法构建含人类HIF-1α基因的AVV载体rAAV-HIF-1α转染BHK21细胞并选择培养获得的G418抗性细胞,即AVV载体细胞株。以重组单纯疱疹病毒感染此细胞株获得rAAV-HIF-1α,PCR技术鉴定病毒,地高辛标记的CMV探针点杂交方法测定重组病毒滴度电泳测定病毒纯度,SDS-PAGE电泳测定病毒纯度,Aβ25-35旅导原代培养海马神经细胞凋亡。Western印迹检测目的蛋白的表达。流式细胞术分析细胞凋亡百分率,激光共聚焦显微镜测定细胞内游离钙离子浓度。结果 PCR证实rAAV-HIF-1α内含有人HIF-1α基因序列,病毒滴度为1×1012/ml,纯度大于98%,感染原代培养海马神经细胞后能够表达目的蛋白,同时可显著降低Aβ25-35诱导海马神经细胞凋亡百分率及细胞内游离子浓度上调(P0.05)。结论缺氧诱导因子-1α基因转染可能通过抑制细胞内游离钙离子浓度上调使海马神经细胞对Aβ25-35产生抗凋亡作用。     

炎性标志物在动脉粥样硬化过程中的变化及其意义

目的　研究炎性因子C -反应蛋白 (CRP)、白细胞介素 - 6 (IL - 6 )和氧化型低密度脂蛋白 (ox -LDL)在动脉粥样硬化 (AS)发病过程中的作用。方法　用维生素D3 加高脂饲料法建立大鼠动脉粥样硬化模型 ,动态观察血清炎性标志物的变化及其与动脉粥样硬化病变程度的相关性。结果　 (1)与实验前比较大鼠血清中CRP水平呈进行性升高 ,在实验 8天、 16天和 2 4天之间差别有非常显著性意义 (P <0 0 1)。 (2 )第 8天血清IL - 6水平与实验前间差别无显著性意义 ;16天、 2 4天时的IL - 6水平与实验前间差别有显著性意义 (P <0 0 0 1) ;第 2 4天时大鼠IL - 6水平是实验前的 2 6倍。 (3)血浆ox-LDL的含量在第 16天与实验前间差别有显著性意义 (P <0 0 5 )。 (4)CRP与IL - 6之间有非常显著性相关 ,(r=0 994 ,P <0 0 0 1) ;IL - 6与ox-LDL之间有显著性相关 (r=0 912 ,P <0 0 5 )。结论　CRP、IL - 6和ox -LDL水平的升高贯穿于AS发生发展的始终 ,3者之间具有明显的正相关性 ,而且与AS的形态学变化相一致。提示检测血清炎性因子水平对于判断AS的病变程度有重要意义