大鼠凝血因子Ⅶ EGFP-EGF1融合蛋白的表达及其结合功能初步研究

本研究通过融合蛋白EGFP-EGF1的表达,探讨大鼠凝血因子Ⅶ上EGF1片段与组织因子（TF）的结合功能。用RT-PCR方法自大鼠肝脏组织获得EGF1编码区基因并将其插入EGFP原核表达载体中,构建pET28a-EGFP-EGF1融合蛋白表达载体;将该重组质粒转化大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达EGFP-EGF1融合蛋白;采用亲和层析方法Ni柱纯化融合蛋白,将融合蛋白作用于经脂多糖刺激表达TF的大鼠血管内皮细胞;通过荧光显微镜及流式细胞术观察和检测融合蛋白与细胞结合情况。结果表明：EGFP-EGF1在转化的大肠杆菌中获得高效表达并成功纯化,SDS-PAGE证实分子量约为36kD。荧光显微镜及流式细胞术检测显示该融合蛋白能与内皮细胞膜上的TF结合。结论：大鼠凝血因子Ⅶ上EGF1区可介导FⅦ与TF特异性结合,从而可能为分子靶向抗栓治疗研究提供部分基础。     

纳米材料在诊断血栓病中的应用

目前血栓病发病率高，其对人类健康危害不亚于肿瘤等恶性疾病。但血栓形成至血管栓塞是一个较长期的慢性过程，待患者出现临床症状就诊时，往往已发生不可逆转的脏器损害。因此，提高血栓病的诊断技术、尽早发现和干预血栓形成是降低血栓病危害的有效策略。     

多发性骨髓瘤细胞脑源性神经营养因子对血管新生作用的研究

目的研究多发性骨髓瘤(MM)细胞脑源性神经营养因子(BDNF)的表达水平及其与MM细胞诱导的血管新生的关系。方法采用RT-PCR法、Western blot法及ELISA法检测MM细胞系KM3、RPMI8226细胞BDNF的表达及分泌。采用MTT法观察MM细胞培养上清液对脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的作用;用改良的Boyden小室法观察MM细胞培养上清液对HUVEC迁移的影响;采用体外小管形成实验,观察MM细胞培养上清液对HUVEC分化的影响。结果KM3、RPMI8226细胞不仅表达BDNF mRNA,也表达和分泌BDNF蛋白,BDNF的基础分泌水平在其生物学作用范围内。KM3、RPMI8226细胞培养上清液均可明显促进HUVEC增殖,含50.0%KM3细胞培养上清液组和完全KM3细胞培养上清液组HUVEC数分别为对照组的(1.85±0.23)倍和(2.16±0.29)倍(P<0.05),抗人类BDNF中和抗体可部分抑制其促增殖活性;含50.0%KM3细胞培养上清液组HUVEC迁移指数为1.85±0.23,完全KM3细胞培养上清液组HUVEC迁移指数为2.16±0.29,与对照组比较,差异有统计学意义(P值均<0.05),并可明显促进基质胶中网状毛细血管形成(P<0.01),抗BDNF中和抗体可明显抑制其作用。结论MM细胞表达和分泌BDNF,BDNF可能参与MM细胞诱导的血管新生。     

改良Nijmegen法检测血友病因子Ⅷ抑制物的探讨

目的评价改良Nijmegen法在检测血友病因子FⅧ抑制物中的应用,以确定改良Nijmegen法替代以往血友病抑制物检测方法的可能性。方法分别应用Nijmegen法和改良Nijmegen法测定79例血友病A患者血浆标本的FⅧ抑制物滴度。两种方法区别在于,改良Nijmegen法检测步骤中,患者血浆及乏因子Ⅷ血浆在与正常血浆37℃混合孵育前均经58℃水浴加热1.5 h。结果 Nijmegen法中有2例结果0.5 BU,43例结果介于0.01～0.49 BU之间,34例为0;改进的Nijmegen法中有2例结果0.5 BU,18例结果介于0.03～0.49 BU之间,59例为0。对两种方法中结果介于0～0.5 BU之间共计77例阴性和可疑阳性者进行卡方检验,应用改良Nijmegen法检测得到阴性检出率明显高于Ni-jmegen法(P0.01);对于结果≥0.5 BU的病例,因样本数过少尚无法对两方法的检测结果进行统计学差别检验。结论样本经58℃水浴处理后能去除血浆标本原有FⅧ因子活性及其他因素的影响,使改良Nijmegen法有可能提高血友病抑制物检测的特异性,此方法有待于在更大样本量中进一步验证。     

凝血因子Ⅶ及其受体相互作用的研究进展

1前言 活化形式的凝血因子Ⅶ及其受体组织因子（TF）形成的TF／FⅦa复合物被认为是引发凝血瀑布的关键蛋白。当血管受损伤时,TF暴露,并与FⅦ或FⅦa1：1结合,TF／FⅦa复合物能增加FⅦa对其底物Ⅸ和FX的蛋白水解活性,所以能激活内、外源性凝血途径。TF／FⅦa复合物在正常生理性止血中发挥着重要作用,并且与血栓性疾病的发生和发展有关,除此之外,TF可在肿瘤细胞和肿瘤血管内皮细胞表达,并参与肿瘤血管生成,促进肿瘤生长、浸润与转移。血浆中FⅦ与TF的水平与多种肿瘤的预后、分化等密切相关。了解TF、FⅦ结构和相互作用机制对于探讨如何有效干预TF／FⅦa复合物形成,从而防治多种疾病的发生和发展至关重要。本文就近年来关于FⅦ及其受体TF的结构功能、结合机制等方面研究进展作一简要综述。     

母体血浆细胞纤维结合蛋白不同时期预测妊娠期高血压疾病的价值

目的:探讨妊娠期高血压疾病患者母体血浆纤维结合蛋白(fibronectin,Fn)在妊娠期间的序列变化以及对疾病的预测价值。方法:采用前瞻性研究方法,对180例妊娠前正常的孕妇,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法,检测母体血浆Fn在妊娠10～14、20～24、30～34周的水平,观察孕妇孕期的变化并随访妊娠结局;同时选取50例正常未孕妇女作未孕对照。结果:①180例中有12例发生妊娠期高血压(妊娠期高血压组),10例子痫前期(4例重度、6例轻度,子痫前期组),158例孕妇妊娠结局正常(正常妊娠组)。②正常妊娠孕妇,母体血浆Fn在妊娠10～14、20～24周维持正常未孕水平,而在妊娠30～34周明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);在妊娠10～14周,子痫前期组、妊娠期高血压组与正常妊娠组母体血浆Fn浓度比较差异无统计学意义;在妊娠20～24、30～34周,子痫前期组与其它两组比较差异有显著统计学意义(P均=0.000),而妊娠期高血压与正常妊娠组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。③通过ROC曲线分析,母体血浆Fn在妊娠20～24、30～34周预测子痫前期曲线下面积分别为0.858、0.846(P均=0.000),妊娠20～24周最佳切入值为388.65 mg/L,其敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比分别为100%、78.24%、21.28%、100%、4.85;妊娠30～34周最佳切入值为416.95 mg/L,值分别为100%、77.06%、20.00%、100%、4.25。结论:子痫前期中晚孕期母体血浆Fn明显升高,而妊娠期高血压保持同期正常妊娠水平;妊娠中晚期母体血浆Fn对预测子痫前期有较好的特异性,妊娠20～24周的预测价值优于妊娠30～34周。     

静脉血栓栓塞症组织因子途径抑制物C 399T和T 287C多态性的研究

目的 分析静脉血栓栓塞症(VTE)患者组织因子途径抑制物(TFPI)基因C-399T和T-287C多态性,探讨TFPI基因多态性与VTE形成的关系.方法 应用聚合酶链反应-限制性片段多态性(PCR-RFLP)的方法检测VTE组110例(其中深静脉血栓患者75例,肺血栓栓塞症患者35例),116例正常人对照组的C-399T和T-287C基因型频率和等位基因频率.结果 VTE组和对照组C-399T和T-287C基因型频数分布均符合Hardy-Weinberg平衡.VTE组患者C-399T具有纯合突变型(TT)个体的频数(23.6%)高于正常对照组(12.1%,P<0.05);杂合突变型(CT)和野生型(CC)两组与正常对照组比较差异均无统计学意义(均P>0.05).VTE组患者TFPI T-287C具有纯合突变型(CC)及杂合突变型(TC),个体的频数与正常对照组比较差异均无统计学意义(均P>0.05). 结论 TFPI基因C-399T多态性与我国人群VTE易感性有关,纯合突变基因型可能是VTE的重要危险因素.而TFPI基因T-287C多态性与我国人群VTE易感性无关.     

The effect of brain-derived neurotrophic factor on angiogenesis

To investigate the in vitro and in vivo proangiogenic effects of brain-derived neurotrophic factor （BDNF）, human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） were isolated and cultured in primary culture. The effect of BDNF on the proliferation of HUVECs was examined by MTT assay. The effects of BDNF on HUVEC migration and tube formation were studied by modified Boyden cham- ber assay and tube formation assay, respectively. Matrigel plug assay and chorioallantoic membrane assay were used to evaluate the effects of BDNF on angiogenesis in vivo. Our results showed that BDNF substantially stimulated the migration and tube formation of HUVECs in vitro, although it did not induce HUVEC proliferation. BDNF also induced angiogenesis both in matrigel plug of mouse model and in chick chorioallantoic membrane. In conclusion, BDNF can promote angiogenesis both in vitro and in vivo, and may be a proangiogenic factor.     

阿霉素纳米粒对白血病耐药细胞株K562/DOX耐药逆转作用的研究

目的　合成阿霉素聚氰基丙烯酸异丁酯纳米粒 ,观察其对阿霉素耐受性细胞株K5 6 2 (K5 6 2 /DOX)耐药性逆转效果并探讨可能机制。方法　采用乳液聚合法合成纳米粒 ,透射电镜观察计算粒径 ,分光光度法计算包封率 ;以梯度浓度的阿霉素纳米粒处理培养的K5 6 2 /DOX细胞 ,噻唑蓝比色法 (MTT)检测K5 6 2 /DOX细胞的半数生长抑制浓度 (IC50 )并计算逆转倍数 ;流式细胞术检测细胞内药物浓度 ;TUNEL法检测药物诱导后凋亡的发生及凋亡率。结果　阿霉素纳米粒平均粒径 (98 5± 3 7)nm ,包封率为 95 % ;MTT结果显示阿霉素纳米粒对K5 6 2 /DOX细胞的生长抑制率较单纯阿霉素显著增高 ,阿霉素纳米粒对K5 6 2 /DOX的耐药逆转倍数为 6 2 ;TUNEL检测经 10 μg/ml阿霉素纳米粒处理后的K5 6 2 /DOX平均凋亡率为 38 7%。结论　以聚氰基丙烯酸异丁酯纳米粒为载体的阿霉素可增强诱导K5 6 2 /DOX细胞凋亡的效率和有效逆转其耐药性。     

肝素诱导的血小板减少及血栓形成的实验诊断

肝素诱导的血小板减少(Heparin-InducedThrombocytopenia,HIT)及血栓形成(Heparin-InducedThrombocytopenia and Thromobosis,HTIT)是肝素治疗的并发症,可分为二型:Ⅰ型为非免疫机制介导的,不伴血小板活化及血栓形成,临床上不需特殊处理;Ⅱ型为免疫机制介导的(以下所述HIT均指Ⅱ