参加美国病理家学会抗磷脂抗体能力验证活动效果分析

目的汇总分析北京协和医院风湿免疫科实验室和全世界参加美国病理家学会(College of American Pathologists,CAP)抗磷脂抗体(antiphospholipid antibodies, aPLs)项目的能力验证(proficiency testing,PT)活动8年的效果,以不断提高监控实验室检测aPLs项目的能力和质量。 方法采用回顾性分析研究。北京协和医院风湿免疫科实验室自2009年1月至2016年12月,每年以邮件方式接收2批,每批3份检测样本,在10 d内采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immununosorbent assay, ELISA)完成抗心磷脂抗体(anticardiolipin,aCL)、抗β2糖蛋白1抗体(anti-β2- glycoprotein 1,aβ2GP1)检测,并将结果回报CAP。 结果本实验室自2009年1月起至2016年12月止,参加CAP的aPLs项目PT活动16次,共96个检测结果,所有结果均为可接受,总PT成绩为100%。8年期间,全世界参加CAP的aPLs项目PT活动的实验室数量逐年增加,2009年第1次PT与2016年第2次PT相比,参加aCL-IgG PT活动的实验室数量增长了24.55%,参加aCL-IgM PT活动的实验室数量增长了24.53%,参加aCL-IgA PT活动的实验室数量增长了20.13%,参加aβ2GP1-IgG PT活动的实验室数量增长了179.73%,参加aβ2GP1-IgM PT活动的实验室数量增长了197.01%,参加aβ2GP1-IgA PT活动的实验室数量增长了151.16%。检测方法逐渐由单一的ELISA变为多种方法学,包括ELISA法、化学发光法、荧光酶免疫分析法和液态芯片技术。全世界的回报结果显示,高滴度阳性和阴性样本检测结果的一致性较好,均高于90%,而低、中等滴度阳性样本检测结果的一致性较差。 结论本实验室的aPLs项目检测结果达到了CAP的能力验证质量要求。全世界越来越多的实验室重视参与aPLs项目的室间质量评价活动,但弱阳性、中等强度阳性的aPLs样本的检测质量仍有待提高。     

去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位基因片段的克隆表达及其检测自身免疫性肝炎的价值

Objective To clone and express the human asialoglycoprotein receptor(ASGPR) H1 subunit, purify and identify the immunoreactivity of the recombinant protein, and establish the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) to detect anti-ASGPR antibodies in diagnosis of autoimmune hepatitis. Methods The CRDHI cDNA (435 bp) was subcloned into eukaryotic vector PEGH, and the recombinant protein expression was induced by D (+)-Galactose. The recombinant CRDH1 was purified with Glutathione Sepharose 4B, and its immunoreactivity was identified by SDS-PAGE and western blot as well as MALDI-TOF. ELISA was established to detect the anti-ASGPR antibodies in serum samples of 45 patients with AIH, 30 patients with SLE, 30 patients with RA, 10 patients with SS and 30 normal controls. Results The sequencing of recombinant plasmid showed the CRDH1 gene was successfully inserted to the eukaryotic expression vector with correct sequence and open reading frame. The fusion protein showed a molecular weight of 42 500 Da on SDS-PAGE gel and confirmed to be the human ASGPR by MALDI-MS through peptide mass fingerprint analysis with Mascot in human protein database. It shared 98. 34% homology with ASGPR H1 subunit. Western blot analysis showed that the fusion protein had the same immunoreactivity as human ASGPR. The results of ELISA indicated that the positive rate of anti-ASGPR was 35.6% ( 16/45 ), but the ELISA was negative in other control. There was significant difference of positivity of the autoantibodies between AIH and non-AIH controls (χ2 = 31.85,P < 0. 01 ). Conclusions The human plasmid containing ASGPR is successfully clone into Saccharomyces cerevisiae Y258. The recombinant autoantigen owns good antigenicity and specificity. ELISA established with the purified protein shows good specificity for diagnosis of AIH.     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中ISGl5mRNA表达水平的研究

目的探讨系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血单个核细胞（PBMCs）中ISG15mRNA表达及其与疾病活动性的关系。方法采用逆转录实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—RT-PCR）的方法，在Light Cycler RealtimePCR检测仪上检测89例SLE患者（活动期50例、缓解期39例）、结缔组织病（CTD）患者34例（疾病对照组）、健康体检者35名（健康对照组）外周血PBMCs中ISG15mRNA的表达水平和含量。以△Ct=Ct（待测基因）-α（内参基因）来比较基因表达水平的变化。结果活动期SLE患者ISG15mRNA表达水平（ACt=2．04&#177;1．07）明显高于缓解期SLE患者（△Ct=5．48&#177;1．72，t=11．572，P〈0．01）；活动期SLE患者ISC15mRNA表达水平（△Ct=2．04&#177;1．07）明显高于疾病对照组（△Ct=5．90&#177;1．72，t=12．69，P〈0．01）和正常对照组（△Ct=5．66&#177;1．63，t=12．359，P〈0．01）；缓解期SLE患者ISG15mRNA表达水平与正常人及疾病对照组的差异无显著性（P〉0．05）。SLE患者FBMCs中ISGl5mRNA的表达水平与SLE疾病活动评分指数（SLEDAI）评分及抗双链DNA抗体呈显著正相关（均P〈0．n1），与补体C3、C4呈显著负相关（均P〈0．01）。结论活动期SLE患者ISG15mRNA表达水平显著高于正常人、疾病对照组和疾病缓解期，提示ISG15的表达可能参与了SLE的发病过程并与疾病的活动性显著相关。     

血清葡萄糖6-磷酸异构酶抗原、类风湿因子和第2代抗环瓜氨酸肽抗体对类风湿关节炎诊断价值的比较

目的 检测葡萄糖6-磷酸异构酶（glucose-6-phosphate isomerase,GPI）抗原在类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）中的表达情况,并比较其与类风湿因子（rheumatoid factor,RF）和第2代抗环瓜氨酸肽（the second generation of anti-cyclic citrullinated peptide,抗CCP2）抗体对RA的诊断价值.方法 采用酶联免疫吸附试验检测126例RA和122例非RA患者血清GPI抗原和抗CCP2抗体,速率散射比浊法检测RF.结果 血清GPI浓度在RA患者较非RA组显著增高,差异有统计学意义[（0.28±0.65） mg/L vs.（0.07±0.36） mg/L,P〈0.005].GPI对RA的诊断敏感性为32.5%,低于RF（69.0%）和抗CCP2抗体（72.2%）的诊断敏感性,差异均有显著统计学意义（P〈0.001）;GPI、RF和抗CCP2抗体对RA的诊断特异性分别为89.3%、87.7%和95.1%,差异无显著统计学意义（P〉0.05）.与单一检测抗CCP2抗体比较,GPI及RF同时阳性、GPI及抗CCP2抗体同时阳性、以及GPI、RF及抗CCP2抗体三项同时阳性的诊断敏感性降低;而GPI或RF、GPI或抗CCP2、以及GPI或RF或抗CCP2单一阳性的诊断特异性降低,均有显著统计学意义（P＜0.05）.结论 血清GPI对RA诊断的敏感性低,可与高敏感性的抗CCP2抗体联合检测.     

临床14 282份标本自身抗体谱检测结果分析

目的 探讨就诊人群中抗核抗体（ANA）、抗心肌抗体（HMA）、抗胃壁细胞抗体（PCA）、抗平滑肌抗体（SMA）、抗肝肾微粒体抗体（LKMA）、抗线粒体抗体（AMA）、抗线粒体抗体M2亚型（AMA—M2）等自身抗体的阳性分布趋势，及其在不同疾病中的分布与疾病诊断的价值。方法 用间接免疫荧光法检测14282份临床血清标本中ANA、HMA、PCA、SMA、LKMA和AMA，用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测AMA—M2亚型；结合患者临床资料分析这些自身抗体在不同年龄、性别和疾病中的阳性分布趋势及临床应用价值。结果 ANA、HMA、PCA、SMA、LKMA、AMA和AMA-M2在14282例就诊人群的阳性率分别为：41．23％、0．19％、3．26％、10．25％、0．11％、11．90％和6．96％。女性中ANA、AMA和AMA-M2阳性率显著高于男性（P〈0．01），人群中ANA、PCA、SMA、AMA和AMA—M2阳性率随年龄增加而升高（SMA为P〈0．05，其余P〈0．01）。在系统性硬皮病（SSc）和系统性红斑狼疮（SLE）ANA阳性率达94．6％和93．9％，自身免疫性肝炎（AIH）中SMA阳性率64．5％，原发性胆汁性肝硬化（PBC）中AMA和AMA-M2阳性率最高，分别为83．2％、70．2％，但其他疾病中也有5．4％-22．6％和1．8％-12．9％不等的阳性率。结论 SLE、SSc、类风湿关节炎（RA）、干燥综合征（SS）和肌炎／皮肌炎（PM／DM）患者中的主要阳性抗体为ANA，AIH患者主要为ANA和SMA阳性，PBC患者主要为ANA、AMA和AMA—M2阳性。但是，同一种自身抗体可以出现在不同的自身免疫性疾病（AID），如AMA可出现在AIH、SS和PM／DM中；一种AID可同时出现多种自身抗体，如AIH息者可出现ANA、SMA、AMA和AMA—M2同时阳性。因此，在临床诊疗中应综合分析，重视抗体滴度在AID诊疗中的作用，以避免片面根据某种自身抗体阳性所致的误诊。     

系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞中Brn-3a mRNA表达水平的研究

目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血单个核细胞中Brn-3a mRNA 表达及其与疾病活动性的关系.方法 以β-actin为内参照,建立逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)方法,在Light Cycler Real time PCR检测仪上检测92例SLE患者(活动期46例,缓解期46例)、其他结缔组织病(CTD)患者30例(疾病对照组)、健康体检者30例(正常对照组)外周血单个核细胞(PBMCs)中Brn-3a mRNA 的表达水平和含量.以ΔCt=Ct(待测基因)-Ct(内参基因)来比较基因表达水平的高低.结果 活动期SLE患者Brn-3a mRNA表达水平明显高于缓解期SLE患者(P<0.01);活动期SLE患者Brn-3a mRNA表达水平明显高于正常对照组与疾病对照组(P<0.01);缓解期SLE患者Brn-3a mRNA表达水平与正常人及疾病对照组差异无统计学显著性意义(P>0.05).结论 活动期SLE患者Brn-3a mRNA表达水平显著高于正常人、疾病对照组和疾病缓解期,提示Brn-3a的表达与SLE的发生发展存在一定关联性,可能参与了SLE的发病过程并与疾病的活动性有关.     

去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位基因片段的克隆表达及其检测自身免疫性肝炎的价值

目的 克隆去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein reeeptor,ASGPR)H1亚单位显性表位435 bp基因片段,构建表达重组质粒,进行表达、纯化,以获得具有免疫活性的ASGPR蛋白,建立间接ELISA法,并探讨其在检测自身免疫性肝炎(AIH)中抗ASGPR抗体的价值.方法 将ASGPRH1亚单位糖类识别区(CRDH1)435 bp的基因片段定向克隆至真核表达载体PEGH,经D-半乳糖诱导表达,表达产物用谷胱甘肽凝胶珠(Glutathione Sepharose4B)亲和纯化,并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(WB)及蛋白质谱(MALDI-TOF)进行免疫活性鉴定,应用表达蛋白建立ELISA法.同时用该方法检测45例AIH、30例SLE、30例类风湿关节炎(RA)、10例原发性干燥综合征(SS)患者、30名健康献血者的抗ASGPR抗体阳性率.结果 经重组质粒测序结果证实,CRDHl/PEGH目的 基因已正确插入真核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;SDS-PAGE检测表达产物为l条相对分子质量42 500的蛋白表达条带.质谱蛋白肽指纹数据通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对,与ASGPR H1亚单位蛋白同源性为98.34%,WB分析表明,重组蛋白具有人ASGPR抗原反应性;间接ELISA检测血清结果显示,AIH组中抗ASGPR抗体的阳性率为35.6%(16/45),非AIH组均为阴性,差异有统计学意义(χ2=31.85,P<0.01).结论 成功克隆的ASGPR H1基因可在啤酒酵母菌中成功表达,且重组的自身抗原具有较好的抗原性和特异性.应用纯化蛋白建_上的间接ELISA检测AIH抗ASGPR抗体具有较好的特异性.     

SELDI-TOF-MS技术在胰腺癌诊断中的应用

目的 应用表面增强激光解析/离子化飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)从胰腺癌患者血清中筛选标志蛋白,找出最佳的标志蛋白组合模式作为临床诊断指标.方法 收集29例胰腺癌患者血清标本和57例年龄、性别相匹配的非癌人群血清标本作为对照.采用SELDI技术检测其蛋白质指纹图谱表达,所得到的结果采用Biomarker Wizard及Biomarker Patterns system软件分析,筛选最终可能用于胰腺癌诊断的蛋白标志物并优化组合建立胰腺癌诊断模型.结果 发现胰腺癌患者和对照组血清蛋白质指纹图谱之间有26个差异表达特异性蛋白,分析系统筛选出一组包含4个标志蛋白(5705、4935、5318和3243 Da)建立起一个胰腺癌的诊断模型,对胰腺癌诊断的敏感性为100%,特异性97.4%.盲法验证此模型敏感性88.9%、特异性89.5%.结论 SELDI-TOF-MS技术的特异性及敏感性远远高于目前所采用的某一单独标志物的血清学诊断,其结果对进一步研究胰腺癌的蛋白质组学改变及其临床诊断应用可能具有重要意义.     

线性免疫印迹法在抗核抗体间接免疫荧光法筛查阴性标本中的临床意义

目的探讨采用线性免疫印迹法（LIA）在抗核抗体（ANA）间接免疫荧光法（1IF）筛查阴性标本中进行抗核抗体谱（ANAs）特异性抗体检测的价值和临床意义。方法对461例IIF—ANA阴性临床血清标本采用线性免疫印迹法进行15种ANAs特异性抗体（LIA—ANAs）检测。结果216例自身免疫性疾病（AID）组标本中LIA—ANAs阳性数为100例,占46．30％,高于非AID组（2000％）;AID组LIA—ANAs阳性结果按灰度强度分,LIA（3＋）、LIA（2＋）、LIA（1＋）、LIA（±）的阳性率均高于非AID组。差异均有统计学意义（均P〈0．05）。AID组中ANAs特异性抗体中的抗Ro-52、抗SS—A、抗Sm、抗nRNP／Sm、抗SS—B抗体、抗dsDNA和抗rRNP抗体的阳性率分别为2．31％～18．06％,高于非AID组,差异有统计学意义（P〈0．05）。AID组中ANAs特异性抗体阳性强度LIA（1＋）＋LIA（4-）的阳性率高于LIA（3＋）＋LIA（2＋）的阳性率,差异有统计学意义（P〈0．01）。抗nRNP／Sm、抗Ro-52、抗SS—A和抗SSB抗体在AID组中阳性率的差异无统计学意义（P〉0．05）;系统性红斑狼疮（SLE）与非SLE比较,抗Sm和抗dsDNA抗体阳性率高于各组,差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论ANA间接免疫荧光法筛查容易导致AID患者部分具有重要临床意义的ANAs特异性抗体漏检,IIF—ANA的检测不能完全代替LIA—ANAs的检测,对于临床疑似AID的患者,无论IIF—ANA检测结果阴性与否。均需进行ANAs特异性抗体检测。     

硬皮病相关自身抗体谱与中国系统性硬化患者临床相关性分析

目的分析硬皮病相关自身抗体谱[包括抗Scl-70抗体、抗RNA多聚酶Ⅲ抗体（ARA-Ⅲ）、抗着丝点抗体（ACA）和抗U1核糖核蛋白（U1RNP）抗体]与中国系统性硬化症（SSc）患者临床特征的相关性。方法前瞻性序贯纳入入选欧洲抗风湿病联盟硬皮病试验研究组（EULAR Scleroderma Trial and Research group,EUSTAR）的92例中国SSc患者,记录其临床表现和实验室检查结果,同时检测抗Scl-70抗体、ARA-Ⅲ、ACA和抗U1RNP抗体。统计分析上述自身抗体与患者各种临床特征之间的相关性。结果 92例患者中,弥漫型SSc65例,局限型SSc19例,重叠综合征6例,伴有雷诺现象的未分化结缔组织病2例。抗Scl-70抗体、ARA-Ⅲ、ACA和抗U1RNP抗体的阳性率分别为55%、13%、13%和25%。存在抗Scl-70抗体者具有较高的皮肤硬化修订Rodnan评分、免疫球蛋白（Ig）M及血小板水平,但肺动脉高压发生率、IgG水平则显著减低（P〈0.05）,与肺间质病变或肾危象的相关性未获证实。ARA-Ⅲ与皮肤硬化评分,毛细血管扩张,心、肺、肾脏受累等临床特点均无显著相关性。存在ACA的患者尿酸水平较高,但关节炎或关节痛症状和肺间质病变少见（P〈0.05）。存在抗U1RNP抗体者肺动脉高压和心脏受累的发生率、IgG和乳酸脱氢酶水平均增高,但白细胞和血小板较低（P〈0.05）。结论在SSc患者血清中检测上述硬皮病相关自身抗体有助于预测某些临床表现和脏器病变的发生。中国患者自身抗体的临床相关性可能与其他地区患者存在种族差异,值得进行更大样本的研究证实。