AMPKα2基因克隆及其野生型和突变型真核表达载体的构建

背景：实验表明,通过激活单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-Activated Protein Kinase, AMPK) α2可以增加胰岛素的敏感性和骨骼肌葡萄糖的摄取,其有望成为预防和治疗2 型糖尿病的新的生理和药理作用靶点。 目的：克隆人的AMPKα2 基因,并构建其野生型和突变型真核表达载体。 设计：单一样本观察。 时间及地点：实验于2007-04/2008-01在中山大学附属第二医院临床分子生物实验室完成。 材料：QuikChange Ⅱ Site-Directed Mutagenesis Kit 为Stratagene公司产品。真核表达载体pcDNA3.1(+),大肠杆菌DH5α为实验室保存。人骨胳肌组织来源于中山大学附属第二医院手术截肢患者,获患者知情同意,新鲜取材后液氮冷冻。 方法: 采用反转录-聚合酶链反应技术从人骨骼肌扩增AMPKα2基因,并将其克隆到T载体,通过测序对其进行鉴定。采用Quickchange定点诱变试剂盒对AMPKα2基因进行体外定点诱变,并将其野生和突变的编码基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1 中,通过酶切和测序进行鉴定。 主要观察指标：①目的基因的克隆。②定点诱变。③真核表达质粒的构建。 结果: 成功克隆了AMPKα2 基因,大小约1 700 bp,与已发表的AMPKα2同源性为99%,GenBank录入号EF056019。成功将AMPKα2第45位Lysine(AAA)突变为Arginine(AGA),成功构建了野生型和突变型pcDNA- AMPK α2 重组质粒。 结论: 实验成功克隆了AMPKα2基因,构建了其野生型和突变型真核表达载体。     

原发性醛固酮增多症筛查中血浆醛固酮/肾素活性比值的影响因素

血浆醛固酮水平/肾索活性比值(ARR)是筛查原发性醛固酮增多症的实用指标.由于影响肾素和醛同酮分泌的因素众多,ARR切点值变异范围较大,至今仍然是一个缺乏标准化的指标.本文综述这些因素,旨在临床上提高ARR的诊断效力.     

甘精胰岛素与格列美脲联合应用治疗口服降糖药控制不佳2型糖尿病的有效性和安全性

目的 评价甘精胰岛素(来得时~(R))与格列美脲(亚莫利~(R))联合应用治疗口服降糖药控制不佳的2型糖尿病的有效性和安全性.方法 采用随机、开放、低精蛋白锌胰岛素注射液(诺和灵N)平行对照和多中心临床研究方法.122例口服降糖药控制不佳的2型糖尿病患者随机分为睡前注射一次甘精胰岛素(n=62)或低精蛋白胰岛素(n=60),清晨口服3mg格列美脲两组,进行为期24周的观察.结果 (1)基线时除甘精胰岛素组口服降糖药物使用的时间显著长于低精蛋白胰岛素组之外,两组其他指标相似;(2)24周时,甘精胰岛素组与低精蛋白胰岛素组的平均HbA_(1C)分别下降了1.38%和1.41%,平均空腹血糖分别从12.30和11.90 mmol/L降至6.05和6.19 mmol/L,日平均血糖降幅分别为5.28和4.56 mmol/L;(3)试验结束时,甘精胰岛素组和低精蛋白胰岛素组分别有46.8%和71.1%的患者发生症状性低血糖(156次和293次),其中严重低血糖事件分别为3.2%和15.0%(2次和21次),夜间低血糖分别为37.1%和61.7%(87次和229次),两组间差异均具有显著统计学意义(P<0.05或P<0.01);(4)甘精胰岛素组与低精蛋向胰岛素组的日平均胰岛素剂量分别从9.7 IU和9.8 IU增至32.5 IU和29.5 IU.结论 与低精蛋白胰岛素比较,睡前注射一次甘精胰岛素和清晨口服3 mg格列美脲联合应用可使口服降糖药控制不佳的2型糖尿病患者得到良好控制,且严重低血糖和夜间低血糖的发生率降低;作为基础胰岛素治疗,甘精胰岛素优于低精蛋白胰岛素.     

尿醛固酮在原发性醛固酮增多症筛查中的价值及钠摄入对其筛查效率的影响

目的探讨尿醛固酮在原发性醛固酮增多症(PA)筛查中的作用并评估钠盐摄入对其筛查效率的影响。方法收集2006-09-2009-07中山大学附属第二医院内分泌科门诊和住院的高血压患者269例,其中包括原发性高血压患者237例(女119例,男118例,平均年龄47.4岁)和PA患者32例(女20例,男12例,平均年龄41.9岁)。所有入组的研究对象均测定立位1h血清醛固酮(SAC)和血浆肾素活性(PRA),并留取24h尿检测尿醛固酮、尿钠和尿钾。通过构建受试者工作特征曲线(ROC),评估尿醛固酮在PA筛查中的效率并确定最佳切点。以尿钠/尿钾作为钠盐摄入的评估方法,以尿钠/尿钾中位数作为切点将原发性高血压组分为高尿钠/尿钾组(n=119)和低尿钠/尿钾组(n=118),分别以这两组高血压人群作为阴性人群,以PA组作为阳性人群进行ROC分析,比较不同钠盐摄入情况对尿醛固酮水平及其PA筛查效率的影响。结果通过构建ROC曲线评估尿醛固酮在PA筛查中的作用,其曲线下面积为0.824(95%CI0.773～0.867,P<0.01),应用Youden’s指数确定尿醛固酮诊断PA的最佳切点值为11.6μg/24h,其敏感性和特异性分别为81.2%(95%CI63.3%～92.7%)和74.3%(95%CI68.2%～79.7%);在原发性高血压患者中,尿醛固酮与尿钠/尿钾呈负相关(r=-0.174,P<0.01)。高尿钠/尿钾组尿醛固酮、SAC和PRA水平明显低于低尿钠/尿钾组。结论尿醛固酮在PA筛查有一定意义,采用11.6μg/24h作为切点可取得较高的筛查效率。钠摄入可影响尿醛固酮水平,但不影响其筛查效率。     

胰岛β细胞分泌功能评估指标的比较--186例不同糖耐量者葡萄糖耐量试验资料分析

目的探讨各种评估胰岛β细胞功能的指标在临床研究中应用的可行性。方法糖耐量正常(NGT)者70名、糖耐量受损(IGT)者56例及2型糖尿病(DM)患者60例参与本试验。各例均行静脉葡萄糖耐量试验和口服葡萄糖耐量试验。计算第一时相胰岛素分泌功能指数(AIR3-5、AIR0-10)、早期胰岛素分泌功能指数(ΔI30/ΔG30)、基础胰岛素分泌功能指数(HOMAβ)、修正的胰岛β细胞功能指数(MBCI)。分析在不同糖耐量组各胰岛β细胞功能指数的变化及相关性。结果NGT、IGT、2型DM患者的AIR3-5分别为(71.80±2.01)mU/L、(27.13±3.25)mU/L、(7.19±3.32)mU/L;ΔI30/ΔG30分别为(11.86±1.78)mU/mmol、(6.50±2.11)mU/mmol、(4.78±2.42)mU/mmol;AIR3-53组间比较均有统计学差异;而ΔI30/ΔG30在IGT及2型DM组间比较差异均无统计学意义,2型DM及IGT组低于NGT组,差异有统计学意义。AIR3-5、AIR0-10均能较好地区分出NGT、IGT、2型DM三者之间的差别,而ΔI30/ΔG30及MBCI不能区分出2型DM与IGT者之间的差别,HOMAβ则不能区分出IGT与NGT者之间的差别。结论在本研究人群中AIR是反映胰岛β细胞分泌功能相对较好的指标,ΔI30/ΔG30及MBCI也可用于临床上粗略评估胰岛β细胞功能。     

人抵抗素基因克隆和蛋白纯化

从人脂肪组织用RT PCR扩增抵抗素基因cDNA并测序 ,PCR产物亚克隆到T载体 ,再克隆到原核表达载体 ,表达质粒转化大肠杆菌并诱导表达 ,以Glutathin Sephrose 4B亲和层析柱纯化了目的融合蛋白。     

NIDDM患者植物神经病变与其它慢性并发症的关系

ＮＩＤＤＭ患者植物神经病变与其它慢性并发症的关系程桦丁鹤林近年来许多研究表明植物神经病变（ＡＮ）与糖尿病患者的昼夜血压变化及其它慢性并发症关系密切，特别是对胰岛素依赖型糖尿病研究得较多［１］，对非胰岛素依赖型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）研究得较少。我们对并发...     

减重治疗对肥胖患者瘦素及心血管疾病危险因素的影响

目的观察减重对血清瘦素水平和心血管疾病危险因素的影响。方法 6 0例肥胖症患者入选为期 2 4周的随机双盲研究 ,单纯生活方式干预组予轻度低热卡饮食及增加有氧运动 ,联合治疗组在此基础上加服奥利司他 12 0 mg,每日3次。观察血清瘦素及心血管疾病危险因素的改变。结果经 2 4周的治疗研究总体体重减轻 (6 .5 1± 4 .4 1) kg(P<0 .0 1) ,联合治疗组减轻体重更显著。血清瘦素水平均较治疗前显著下降 ,但调整体质指数后无差异。同时血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、血压、空腹血糖、胰岛素水平及胰岛素抵抗指数明显下降。联合治疗组改善糖脂代谢更明显。结论肥胖患者予生活方式干预及联合应用奥利司他治疗均能获得良好减重效果 ,同时显著改善心血管疾病的危险因素 ,奥利司他更显著     

含短胞内段的SD大鼠全长瘦素受体的cDNA克隆

肥胖是现代社会的常见病 ,是胰岛素抵抗综合症的组成部分 ,它的分子发病机制多年来一直不清楚 ,1994年瘦素基因 (ＯＢ基因 )和 1995年瘦素受体基因 (ＯＢＲ基因 )的克隆成功[1,2 ] ,使肥胖症的分子发病机制研究进入了新的时代。目前已知瘦素是由脂肪细胞分泌 ,具有降低食欲、增     

GLP-1、Betacellulin、Activin A、bFGF和Nicotinamide联合诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞

[目的]探讨体外联合应用GLP-1、betacellulin、activin A、bFGF和nicotinamide 5种生长因子能否将小鼠胚胎干细胞(ES细胞)诱导分化为胰岛素分泌细胞.[方法]以GLP-1、betacellulin、activin A、bFGF和nicoti-namide 5种生长因子诱导E14.1小鼠ES细胞30 d后,应用RT-PCR、DTZ染色和免疫组化检测分化细胞胰岛素表达,以流式细胞仪检测胰岛素分泌细胞的分化率,用RIA法测定培养液中胰岛素水平.[结果]分化细胞可检测到胰岛素mRNA表达,DTZ染色和胰岛素免疫组化染色阳性,胰岛素分泌细胞的分化率平均为13.6%±3.7%,在5.6 mmol/L和25 mmol/L葡萄糖浓度作用下培养液中胰岛素水平分别为(0.04±0.01)ng/mL和(0.09±0.02)ng/mL.[结论]体外联合应用GLP-1、betacellulin、activin A、bFGF和nicotinamide 5种生长因子能将小鼠ES细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞,但胰岛素分泌功能较差.