siRNA对腺样囊性癌细胞survivin基因蛋白表达与细胞增殖的影响

目的应用RNA干扰技术靶向阻断survivin基因表达，探讨其蛋白表达水平及对细胞增殖抑制作用。方法将siRNA真核表达载体Pgenesil-sur通过脂质体介导转染腺样囊性癌细胞，采用免疫组化法检测survivin基因蛋白表达；并用图象分析仪分析蛋白表达强度及表达抑制率。MTT法检测对腺样囊性癌细胞增殖的抑制作用。结果空白对照组、空质粒载体组、RNA干扰组survivin蛋白表达强度分别为：2．52±0．10，2．48±0．11，0．53±0．10。经统计学分析表明转染Pgenesil—sur真核表达载体后。survivin基因蛋白表达水平明显减低（P〈0.05），其抑制率达到79％；转染空质粒载体与空白对照组差异无统计学意义（P〉0．05）；MTT法结果表明转染Pgenesil—sur真核表达载体后细胞增殖受到显著抑制，抑制率为38．80％（P〈0．05）；转染空质粒载体细胞增殖未受到抑制（P〉0．05）。结论靶向survivin siRNA能抑制体外培养的腺样囊性癌细胞survivin基因蛋白表达与细胞增殖作用。     

柚皮苷对人牙周膜细胞功能调节的作用

目的:通过研究中药有效成分柚皮苷对人牙周膜细胞(hPDLCs)增殖、矿化成骨及骨保护素(OPG)表达的影响,探讨柚皮苷对人牙周膜细胞增殖及成骨功能的调节作用。方法:采用酶消化结合组织块法,体外原代培养hPDLCs,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、酶联免疫吸附法和半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)等方法,测定不同质量浓度(100、10、1.0、0.1、0.01mg/L)柚皮苷作用后,hPDLCs增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性、Ⅰ型胶原蛋白、OPG表达的变化,采用SPSS16.0统计包对数据进行统计学处理。结果:原代培养的hPDLCs形态良好,1.0mg/L浓度组的柚皮苷对hPDLCs增殖、ALP活性和Ⅰ型胶原蛋白表达的促进作用最强,此浓度柚皮苷对细胞OPG mRNA的调节作用在测定时段内呈时间依赖性。结论:柚皮苷有促进hPDLCs增殖及向成骨方向转化的作用。     

联合应用柚皮苷及黄芩苷对人牙周膜细胞生物学活性的影响

目的:观察中药有效成分柚皮苷和黄芩苷联合应用对人牙周膜细胞(hPDLCs)生物学活性的作用。方法:用酶结合组织块法原代培养hPDLCs;通过MTT法、酶联免疫吸附法、诱导矿化实验测定二者配比之后对hPDLCs增殖、Ⅰ型胶原蛋白的表达、碱性磷酸酶(ALP)活性及钙化结节形成的影响。结果:1.0 mg/L的柚皮苷与0.1 mg/L黄芩苷配伍对细胞增殖、Ⅰ型胶原蛋白表达、ALP活性以及矿化的促进作用明显。结论:柚皮苷与黄芩苷配伍组合可增强hPDLCs的成骨能力。     

扁平苔藓患者与正常人口腔黏膜差异蛋白的质谱分析

[摘要] 目的 探讨正常人与口腔扁平苔藓（OLP）患者口腔黏膜的差异蛋白。 方法 对正常人与OLP的口腔黏膜进行蛋白质的提取,对标本进行双向凝胶电泳并对图像进行扫描分析,寻找可能的差异蛋白。肽质量指纹图谱鉴定差异蛋白,PMF图象收集及在线检索,实现对蛋白质的鉴定,并对其进行分析。结果 OLP与正常人口腔黏膜组织差异表达蛋白质点数为28个,其中20个点在OLP中为高表达,8个点在OLP中为低表达（P＜0.05）。选取分辨清楚的10个差异蛋白质点进行MALDI-TOF-MS检测,鉴定出5个蛋白质,其中角蛋白II型表皮细胞骨架2、波形蛋白、胞质动力蛋白重链1及纤维蛋白原β链在OLP患者中高表达,载脂蛋白A1在OLP患者中低表达。结论 获得了OLP患者与正常人的蛋白质双向电泳图谱,发现OLP患者与正常人的口腔黏膜组织之间存在蛋白质表达差异,鉴定出的特异蛋白质提示OLP的发病过程可能有细胞骨架体系的参与并支持OLP的发病与微循环障碍及高粘血症有关。     

存活素蛋白Survivin在SD大鼠牙胚发育中的表达

目的观察存活素蛋白在SD大鼠牙胚发育过程中的表达,探讨其在牙胚发育过程中的作用。方法建立SD大鼠牙胚发育模型,用免疫组化方法检测存活素蛋白在SD大鼠牙胚不同发育时期中的表达情况。结果图像分析显示存活素蛋白的表达在胎鼠牙胚的蕾状期增强,帽状期、钟状早期减弱,出生后再增强以后随着发育的进行逐渐减弱,呈双波形变化趋势,经统计学检验出生后3.5d与出生后5.5d之间的差异无显著性,其他各组之间均存在显著性差异。结论存活素蛋白可能参与了牙胚发育过程。     

存活素蛋白Survivin在SD大鼠牙胚发育中的表达

目的观察存活素蛋白在SD大鼠牙胚发育过程中的表达,探讨其在牙胚发育过程中的作用。方法建立SD大鼠牙胚发育模型,用免疫组化方法检测存活素蛋白在SD大鼠牙胚不同发育时期中的表达情况。结果图像分析显示存活素蛋白的表达在胎鼠牙胚的蕾状期增强,帽状期、钟状早期减弱,出生后再增强以后随着发育的进行逐渐减弱,呈双波形变化趋势,经统计学检验出生后3.5d与出生后5.5d之间的差异无显著性,其他各组之间均存在显著性差异。结论存活素蛋白可能参与了牙胚发育过程。     

口腔扁平苔藓患者40例幽门螺旋杆菌的检测及意义

目的:探讨糜烂型扁平苔癣与幽门螺旋杆菌(HP)的相关性。方法:应用聚合酶链反应技术,对糜烂型扁平苔癣患者的口腔黏膜进行幽门螺旋杆菌脱氧核糖核酸的检测,比较与正常黏膜存在情况的差异。结果:对照组20例,HP呈阳性为1例。病例组40例,HP呈阳性为14例。两者存在显著性差异。结论:以糜烂型口腔扁平苔癣患者口腔黏膜中HP的存在情况为着手点,去除了胃肠道疾病的影响。正常组与糜烂型扁平苔癣病例组HP的存在有显著性差异,表明HP的存在与口腔扁平苔癣糜烂的发生密切相关。     

白色念珠菌3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及表达

目的 构建白色念珠菌3-磷酸甘油醛脱氧酶（GAPDH）的表达载体并使其在大肠杆菌中正确表达.方法 提取基因组总RNA,PCR方法获得GAPDH基因,构建其原核表达质粒pET-32a（＋）-GAPDH,转化大肠杆菌BL21菌株,经IPTG诱导产生蛋白,用SDS-PAGE和Western Blotting检测GAPDH蛋白表达情况.结果 构建的白色念珠菌GAPDH基因表达质粒经序列测定证实,与GenBank数据完全一致.双酶切鉴定证实,克隆基因正确插入pET-32a（＋）载体.在1.0 mmol·L-1的IPTG浓度诱导下表达,可观察到相对分子量51kDa的蛋白,经SDS-PAGE和Western Blotting检测证实为GAPDH蛋白.结论 实验成功克隆白色念珠菌GAPDH基因,并在大肠杆菌中正确表达,为白色念珠菌感染的候选疫苗奠定工作基础.     

rAAV-hBMP7的包装纯化及感染滴度的测定

目的:包装纯化具有感染性的腺相关病毒rAAV-hBMP7,检测其包装效率及感染滴度。方法:应用AAV Helper-Free System、磷酸钙三质粒共沉淀法,将病毒质粒pAAVIRES-hrG-FP-hBMP7、辅助质粒pAAV-Helper和包装质粒pAAV-RC转染AAV-293细胞,进行病毒包装,荧光计数法测定病毒包装效率;反复冻融收获病毒液,按氯仿处理、PEG/NaCl沉淀的方法浓缩纯化;纯化的病毒液感染AAV-HT1080细胞观测荧光表达,原位β-半乳糖苷酶染色测定病毒感染效率和滴度。结果:转染AAV-293细胞后6h即有绿色荧光表达,包装效率为94.16±0.13%。纯化的rAAV-hBMP7在HT1080细胞中的感染效率为78%,计算病毒物理滴度为2.34×1011v·g/ml。结论:磷酸钙三质粒共沉淀法可实现病毒在AAV-293细胞中的高效包装,纯化的rAAV病毒载体能介导hBMP7基因转染真核细胞并具有较高的转染效率和感染滴度。     

hBMP-7基因重组腺相关病毒载体的构建及人牙髓细胞转染的研究

目的:构建人骨形成蛋白-7(hBMP-7)基因重组腺相关病毒载体,并转染牙髓细胞,为牙组织损伤修复的基因治疗做探索性研究。方法:以含hBMP-7全长cDNA的载体PTcDNA-hBMP-7为模板进行PCR扩增,将回收产物和pAAVIRES-hrGFP分别双酶切后连接、转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,获得重组质粒pAAVIRES-hrGFP-hBMP-7。采用磷酸钙共沉淀法转染293细胞进行病毒包装,收获的病毒液按氯仿处理、PEG/NaCl沉淀、酚:氯仿反复抽提法浓缩纯化,斑点杂交法测病毒滴度,并转染体外培养的牙髓细胞。结果:酶切鉴定和测序结果表明,hBMP-7基因成功克隆入pAAVIRES-hrGFP载体中。在293细胞中包装出重组腺相关病毒载体rAAVIRES-hBMP-7,物理滴度为3.0×1011v.g/ml。rAAV转染牙髓细胞后GFP表达逐渐增强,可持续表达到4周以后。结论:重组腺相关病毒载体rAAVIRES-hBMP-7,能有效转染牙髓细胞表达目的基因。可用于牙组织工程基因治疗的研究。