噬菌体抗体库技术的构建及应用研究进展

噬菌体抗体库（phage antibody library）技术是由噬菌体展示技术发展而来的一项新型抗体制备技术。噬菌体抗体库技术的基础,噬菌体展示技术,发展自上世纪80年代中期。1985年,美国密苏里大学的Smith[1]首次证实丝状噬菌体fd基因组能通过基因工程的手段加以改造。     

梅毒螺旋体IgG和IgM抗体国家一级血清标准物质的研制

目的 研制国内用于TP的IgG和IgM抗体检测的国家一级标准物质,以促进临床实验室TP抗体检测的室内质量控制、试剂方法评价,实验室能力验证及量值溯源等.方法 筛选2份TP抗体强阳性血浆,分别用阴性的血浆稀释至约1 IU/ml( 200851)和20 mlU/ml( 200852),分装,真空干燥后,研究制备物不同温度(- 70、37、-20、2～8℃,室温和反复冻融)和时间(3d,1、2、3、4周等)的长期稳定性和短期稳定性.然后,从分装后样本中抽取20份进行均匀性研究.并采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)、免疫印迹、甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)和TP明胶凝集试验( TPPA)法,分别与国际标准物质(NIBSC编号:05/132和05/122)同时检测比对定值.最后进行不确定度分析.结果 制备物长期保存稳定性良好,37℃可稳定4周,室温可稳定8周,2～8℃可稳定16周,-20℃可稳定32周.比较2种制备物的1～20号样本和混合样本检测结果的组间方差和组内方差,制备物200851与200852的F值均小于F0.01(1.38)=7.35,其均匀性良好.ELISA、免疫印迹、TRUST和TPPA 4种检测方法的定值结果相同,经不确定度分析,200851和200852定值结果可分别表示为( 1.27±0.26) IU/ml和(19.4±4.4) mlU/ml.结论 制备物稳定性和均匀性结果均符合国家一级标准物质的要求.这2种制备物可分别作为国内不同方法检测TP的IgG和IgM抗体的血清标准物质.     

病毒载体在类风湿关节炎基因治疗中的应用

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的慢性系统性自身免疫性疾病,临床表现为以小关节受累为主的对称性、持续性多关节炎,最终可导致关节畸形和功能丧失.近年来,一些针对炎症性细胞因子的拮抗剂和单克隆抗体,如肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α拮抗剂、白细胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6拮抗剂等,表现出比传统药物更显著的疗效[1],但这些生物制剂有可能导致一些不良的反应,有待临床试用中观察.随着基因转移技术的发展,基因治疗作为一个新兴的治疗方式,在多种疾病的研究中展现出其特有的优势,也为RA的治疗提供了一种新的靶向治疗策略.     

无偿献血者中HIV阳性者的病毒载量分析

目的分析无偿献血者艾滋病病毒(HIV)阳性标本的病毒载量水平及无偿献血人群HIV的携带状态,为评估无偿献血人群HIV感染风险提供依据。方法收集2016—2018年国内25家血站HIV筛查反应性(R)的血浆标本683(人)份,根据HIV反应性类型分为ELISA双试剂反应性组(ELISA R-R)、核酸检测(NAT)反应性组(NAT R),ELISA单试剂反应性组(ELISA R-NR),使用电化学发光试剂法做HIV抗原抗体检测,使用核酸定量试剂做HIV RNA定量检测,核酸定量检测低于检测下限(80 IU/mL)的标本以WB法确认。结果本组无偿献血者筛查R标本中,1)HIV确认阳性率为27.1%(185/683),确认阳性样本ELISA R-R标本占89.2%(165/185),ELISA NR-NR+NAT-R占8.1%(15/185),ELISA R-NR占2.7%(5/185),3(种)组病毒载量(IU/mL)分别集中在10~(4.605±0.047)、10~(3.472±0.328)和10~(5.196±0.655)(P0.05);HIV窗口期标本病毒载量(IU/mL)10~5者占20.0%(4/20),其中2例来自ELISA R-NR组,2例来自NAT R组;30.0%(6/20)为10~4者,其中2例来自ELISA R-NR组,2例来自NAT R组;其余50.0%(10/20)为10~1—10~3者,其中1例来自ELISA R-NR组,剩余9例来自NAT R组。2)在HIV确认阳性者中发现3名疑似HIV精英控制者(ECs)。结论我国无偿献血者中HIV ELISA R-R感染者病毒载量较抗原抗体窗口期感染者高;HIV窗口期感染者中多为低载量病毒感染者。疑似HIV ECs的发现揭示我国无偿献血人群HIV感染状态日益复杂多样化,需要加强对血液筛查实验室检测质量的管理,探究更合理的HIV筛查策略。     

耐核糖核酸酶内含长片段嵌合体RNA的病毒样颗粒的构建和表达

目的 通过改变原噬菌体ms2包膜蛋白RNA包装位点(19碱基的茎环结构)的数量及亲和力,构建新的原核表达系统,探讨表达内含长片段(达到理论上的1 900 bp)RNA的耐RNase病毒样颗粒的可能性.方法 首先设计含Hind Ⅲ和Not Ⅰ酶切位点的引物,扩增ms2包膜蛋白的编码成熟酶蛋白和衣壳蛋白的1 700 bp序列,并将原来的19mer的包装位点序列改变为C-5变异体(19 bp stem-loop结构中-5位的尿嘧啶改变为胞嘧啶),Hind Ⅲ和Not Ⅰ酶切后,与用同样酶切的表达载体pET-28(b)相连接,得到重组载体pET-ms2-pac.应用重叠PCR扩增3种病毒的5段嵌合体序列(包括3段SARS-CoV基因、一段HCV基因和一段HSN1基因),并在SARS-CoV3和HCV序列之间插入一个19mer的变异体包装位点序列,在设计引物时,使嵌合体两端含有Not Ⅰ酶切位点,与Not Ⅰ酶切的重组载体pET-ms2-pac相连接,构建得到具有2个变异包装位点的表达载体pET-ms2-3V.同时构建3种对照重组表达载体,分别测定N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C、P-3V-pET-P和pET-ms2-3V 4种重组表达质粒表达产物的260 nm吸光度(A260)值,根据公式A160=0.125 mg/ml计算4种表达产物的表达效率.结果 成功构建了4种原核表达载体:pET-ms2-3V、P-3V-pET-P、N-P3V-pET-P和N-P3V-pET-C.pET-ms2-3V和P-3V-pET-P经原核表达后得到含全长为1 891的5段嵌合体RNA的病毒样颗粒;N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C其原核表达产物病毒样颗粒中仅包装了1 200 bp的目的 嵌合体RNA.N-P3V-pET-P、N-P3V-pET-C、P-3V-pET-P和pET-ms2-3V的表达效率分别为0.23、0.35、0.35和0.51 mg/ml.N-P3V-pET-C比N-P3V-pET-P表达效率高52%,而pET-ms2-3V比P-3V-pET-P表达效率高38%.所包装的RNA具有耐RNase和DNase消化的特性以及良好的不同温度条件下的稳定性.结论 通过改变噬菌体ms2 RNA包装位点(19碱基的茎环结构)的数量,可构建能表达内含达到理论上的约1 900 bp外源RNA的耐RNase病毒样颗粒的原核表达载体平台.通过应用包装位点的变异体C-变异体,可以增加病毒样颗粒的表达效率.     

一九九三年全国乙肝标志物免疫学检验室间质量评价

一九九三年全国乙肝标志物免疫学检验室间质量评价王露楠，王文丽，郑怀竞１９９３年全国乙型肝炎病毒标志物免疫学检验室间质量评价活动中，我们向全国３０个省、市、自治区的３４３家单位发放了质控物，有３３６家按时回报了检测结果，回报率达９８．７％，其中包括３０...     

HBsAg阴性献血者血清(浆)HBV DNA检测的意义

目的　明确HBsAg阴性献血者血清 (浆 )HBVDNA检测的应用价值。 方法　采用聚合酶链反应 (PCR)检测HBsAg阴性献血者血清 (浆 )HBVDNA。如HBVDNA为阳性 ,则进一步检测乙肝“两对半”血清学指标。结果　 5 0 0份标本中有 1 4份为HBVDNA阳性 ,检出率为 2 .8%。进一步检测其它HBV感染的血清学指标 ,发现这 1 4份标本中有 5份表现为抗 HBs、抗 HBe和抗 HBc一项或两项阳性。对HBVDNA的定量测定表明 ,其含量在 1 0 4～ 1 0 6拷贝数 /ml。结论　为尽可能减少输血后HBV感染的发生 ,有必要采用PCR方法检测HBsAg阴性献血者血清 (浆 )HBVDNA     

无偿献血人群中HIV-1感染者env基因序列特征研究

目的 分析我国无偿献血人群艾滋病病毒I型（HIV-1）感染者病毒亚型及env基因C2-V4区序列特征。方法 针对我国13个省市献血人群筛选的115例HIV-1阳性标本,扩增HIV-1的env基因C2-V4区片段并测序;构建最大似然树（Maximum Likelihood）分析不同亚型env基因序列的进化关系;分析该基因区序列变异以及2G12、PGT135、PGT128中和表位特征。结果 从115例HIV阳性标本中成功扩增C2-V4区76份,经测序分析发现HIV-1基因亚型7种,其中,亚型CRF01_AE和CRF07_BC所占比例最高,分别占46.0%（35/76）和39.5%（30/76）,其他亚型CRF08_BC、B、CRF65_CPX、CRF59_01B、CRF61_BC所占比例分别为5.3%（4/76）、5.3%（4/76）、1.3% （1/76）、1.3% （1/76）、1.3% （1/76）。V3环顶端四肽存在GPGQ、GPGR、GPGK、GQGR四种类型,辅助受体以CCR5（90.8%）为主。97.1%的CRF01_AE毒株分别缺失2G12和PGT135抗体识别的相关糖基化位点,而CRF07_BC毒株100%缺失2G12抗体识别相关的糖基化位点,80%毒株未缺失PGT135抗体识别相关的糖基化位点。结论 我国献血人群HIV-1感染者以CRF01_AE和CRF07_BC为主要流行毒株;各毒株亚型V3顶端四肽以GPGQ变异型为主,且主要使用CCR5为辅助受体;2G12、PGT135及PGT128中和抗体表位呈现不同程度的变异。该研究为进一步开展针对献血人群的艾滋病预防与控制提供了参考数据。     

临床基因扩增检验实验室设置要求依据是什么?

答 :卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发 [2 0 0 2 ] 10号 )中对临床基因扩增检验实验室的分区及设备配置作了明确规定临床基因扩增检验实验室设置要求依据是什么?@王露楠     

T载体克隆在病毒样颗粒表达载体构建中的应用

目的提高带某些限制酶切位点聚合酶链反应(PCR)扩增产物克隆入表达载体的效率。方法将带Hind Ⅲ酶切位点的PCR扩增产物与T载体连接，转化BL21-DE3 E．Coli，提取质粒后，用Hind Ⅲ酶切，电泳分离并提取纯化的目的片段。然后，与经过相同的限制性酶酶切的表达载体pNCCL1连接。结果经T载体克隆酶切构建的内含严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS—CoV)核酸的病毒样颗粒表达载体，方法简单快速，每次均可获得成功。而采用直接酶切扩增产物的构建方法，未获得成功构建的表达载体。结论T载体克隆可用于对直接酶切效果不好(如Hind Ⅲ)的PCR扩增片段的表达载体的连接构建，方法简便高效。