A549/MTX对映体耐药细胞的裸鼠荷瘤模型的建立

目的利用L型和D型氨甲喋呤（MTX）对映体分别建立人肺腺癌A549细胞株裸鼠耐药模型,为进一步揭示MTX对映体体内活性差异的原因提供实验平台。方法裸鼠皮下分别接种A549、耐药细胞株A549/L-MTX、A549/D-MTX各6×10^6个/0.2ml,观察肿瘤生长特性;瘤体原代培养后四甲基偶氮唑兰（MTT）法检测耐药指数（resistance index RI）;免疫组化（IHC）检测ki-67、多药耐药相关蛋白1（multidrug resistance-associated protein1,MRP1）、survivin变化。结果从肿瘤生长曲线上看瘤体积三者差异有统计学意义（P〈0.05）,A549/L-MTX/nude组体积更小。A549/L-MTX/nude移植瘤RI为4.9,为低度耐药,A549/D-MTX/nude移植瘤RI为14.5,为中度耐药。A549/L-MTX/nude相关蛋白总体表达低于A549/D-MTX/nude,两者表达差异有统计学意义（P均〈0.05）。结论成功建立对MTX两种对映体耐药的A549细胞株裸鼠肿瘤模型,且两种耐药细胞具有不同耐药特性,为研究MTX对映体体内抗肿瘤活性差异提供了较好的实验平台。     

氨甲蝶呤耐药细胞内整体DNA甲基化水平检测方法的建立及其应用

目的 建立一种简便快速检测细胞内整体DNA甲基化水平的方法,以用于临床甲基化诊断.方法 采用高效毛细管电泳技术,以pH 9.6的48 mmol/L碳酸氢钠溶液[含60 mmoL/L十二烷基硫酸钠(SDS)]为分离缓冲液,检测波长为256 nm,在20 kV电压下,0.7 psi压力进样时间5 s,对2'-脱氧胞苷(dC)、5-甲基-2'-脱氧胞苷(mdC)、2'-脱氧腺苷(dA)、2'-脱氧胸苷(dT)、2'-脱氧鸟苷(dG)5种物质进行分离.在此基础上检测氨甲蝶呤(MTX)诱导的肺癌A549耐药细胞株内整体DNA甲基化水平.结果 通过不断优化分离缓冲液中SDS浓度(40、60、80 mmol/L)、pH值(9.4、9.6、9.8)、分离电压(15、17、19、20、22 kV)、进样时间(5、10、15、20、30 s)和毛细管温度(15、20、25、30℃),建立高效毛细管电泳检测细胞内整体DNA甲基化水平的方法,可在10 min内实现dC、mdC、dA、dT、dG的完全分离,其日内变异系数(CV)<0.2%,日间CV<2%,最低检出限为2μmoL/L.检测肺癌A549亲本细胞甲基化水平为(4.80±0.52)%;而不同浓度(15、30、40 μmol/L)MTX诱导耐药A549细胞株的甲基化水平分别为(4.20±0.44)%、(3.70±0.36)%、(3.10±0.35)%.结论 建立高效毛细管电泳检测整体DNA甲基化水平的方法具有高效、快速、简单、灵敏的特点;MTX耐药细胞株内整体DNA甲基化水平随着耐药浓度的增加明显降低.     

超氧化物歧化酶基因多态性与慢性阻塞性肺疾病的关系

目的 探讨超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)基因多态性与慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的关系,进一步揭示COPD的遗传易感因素、发病机制.方法 联合应用聚合酶链式反应(PCR)与连接酶检测反应(LDR)测序分型技术检测80例COPD患者(COPD组)、80例长期吸烟而肺功能正常人群(长期吸烟组)和40例无吸烟史的健康人群(对照组)的SOD1-3基因多态性情况,并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中SOD3浓度.结果 入选对象中检测到SOD1的AA和AC基因型、SOD2的TT、TC和CC基因型以及SOD3的CC和CG基因型.AA和AC基因型在COPD组、长期吸烟组和对照组间的分布频率分别为91.3％、92.5％、90.0％与8.7％、7.5％、10.0％,差异无统计学意义(P＞0.05.TT、TC和CC基因型在相应3组间的分布频率分别为67.5％、65.0％、57.5％,21.3％、25.0％ 、30.0％和11.2％、10.0％、12.5％,差异无统计学意义(P＞0.05).CC和CG基因型在此3组间的分布频率分别为97.5％、87.5％、97.5％和2.5％、12.5％、2.5％,其中CG基因型在长期吸烟组出现的频率高于其他2组,差异有统计学意义(P＜0.05).携带SOD3CG基因型人群血清SOD3浓度为(252.1±46.6) U/ml,未携带者血清SOD3浓度为(45.5±23.2) U/ml,两者差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 SOD3基因多态性(C+760G,Arg213Gly)与COPD的易感性有关.     

肿瘤基因启动子区异常甲基化与肿瘤的发生

肿瘤的发生和发展是一个与多基因、多步骤的致癌因素相关的复杂过程,包括了原癌基因及肿瘤抑制基因的改变、错配修复基因的突变、DNA甲基化和微卫星不稳定性。癌基因的低甲基化与抑癌基因的高甲基化在肿瘤发生、发展中的基因表达调控、基因结构的稳定等方面发挥重要作用。DNA甲基化是指生物体在DNA甲基转移酶的催化下,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体,将甲基转移到特定碱基上的过程。甲基化异常被认为是肿瘤的一个特征,是基因组中一种重要的表观遗传修饰,与肿瘤的发生、浸润及转移相关。基因局部甲基化模式的改变已成为令人瞩目的研究领域。本文就DNA甲基化及肿瘤基因启动子区甲基化研究的相关进展作简要综述。     

氨甲蝶呤对映体耐药A549细胞的表皮生长因子受体基因表达及迁移能力

目的研究氨甲蝶呤(MTX)对映体耐药人非小细胞肺癌A549细胞的迁移能力以及表皮生长因子受体(EGFR)mRNA的表达。方法用细胞划痕试验检测L-(+)-MTX/A549细胞和D-(-)-MTX/A549细胞的迁移能力;双层软琼脂克隆试验检测L-(+)-MTX/A549细胞和D-(-)-MTX/A549细胞的克隆形成率并观察集落的形态;用RT-PCR检测亲本A549细胞、L-(+)-MTX/A549细胞和D-(-)-MTX/A549细胞中EGFR mRNA的表达。结果加入MTX 72 h后D-(-)-MTX/A549细胞的迁移能力(1 230.1±40.2)高于L-(+)-MTX/A549细胞(530.3±25.4);D-(-)-MTX/A549细胞、L-(+)-MTX/A549细胞和亲本A549细胞的克隆形成率(%)分别为(1.38±0.17)、(1.36±0.13)和(1.37±0.15),差异无统计学意义(P>0.05);亲本A549细胞、L-(+)-MTX/A549细胞均有EGFR mRNA表达,其光密度值(IDV)分别为(6 630±64)、(3 697±27),差异有统计学意义(t=103.42,P<0.01)。而D-(-)-MTX/A549细胞不表达EGFR。结论 D-(-)-MTX诱导的A549细胞的迁移能力大于L-(+)-MTX。EGFR基因表达具有手性差异。     

高效毛细管电泳测定海马组织和脑脊液中氨基酸类神经递质

目的建立测定大鼠海马组织和人脑脊液中氨基酸类神经递质的高效毛细管电泳分析方法。方法用高效毛细管电泳技术,选用总长60 cm、有效长度50.5 cm、直径75μm熔融石英毛细管,在20 kV电压下快速分离4种氨基酸。以100 mmol/L硼酸-三羟甲基氨基甲烷(Tris)(1∶1,含1%异丙醇)为电泳缓冲液(pH值为10.35),激光诱导荧光检测器进行检测,并对此方法进行方法学评价。同时检测45例患者脑脊液的氨基酸含量。结果谷氨酸(GLU)、天冬氨酸(ASP)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(GLY)4种氨基酸能在15 min内分离,线性范围为1.0~100.0μmol/L,GLU、ASP、GABA、GLY最低检出限分别为10、23、18、15 nmol/L,4种氨基酸的批内精密度范围4.44%~9.72%,批间精密度范围6.96%~10.50%。4种氨基酸的回收率不低于88.1%。全面性大发作癫痫患者GLU、GLY、ASP含量显著高于对照组(P<0.05),而GABA较对照组差异无统计学意义;复杂部分性发作癫痫患者4种氨基酸含量较对照组显著增加(P<0.05)。结论高效毛细管电泳具有快速、灵敏、准确的特点,为临床和科研提供了一种有效的方法。     

一种检测细菌性阴道病方法的建立及临床评价

目的评估一种国内自主建立利用唾液酸酶检测细菌性阴道病(BV)方法的临床应用价值。方法比色法探索研发试剂与酶标准品的最佳反应条件,包括底物溶液的pH值和反应的最适温度及时间。采用研发试剂、BV BLUE、临床现用国产试剂盒对临床标本进行检测,判断研发试剂的临床应用价值。结果研发试剂在pH值6.0~6.2、37℃10 min时与酶标准品达到最佳反应,与BV BLUE相比,检出限相同时研发试剂底物用量仅为BV BLUE的1/2.78。临床实验中,研发试剂与BV BLUE对BV的检测效果差异无统计学意义(P=1.000,Kappa=0.905),符合率为96%。而国产试剂盒与BV BLUE对BV的检测效果差异有统计学意义(P=0.000,Kappa=0.362),符合率为65%。结论研发试剂可以达到与BV BLUE相同的检出效果,其快速、方便、可信度高且成本较低,优于国内类似产品,更有利于在临床推广和使用。     

利用EP5-A2文件的方法评价实时荧光定量PCR检测HBV DNA的精密度

目的评价本实验室荧光定量PCR方法(Real-time PCR)测定HBV DNA结果的精密度。方法按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)EP5-A2文件C1附录要求,对浓度约为107(copies/ml)(S7)、105(copies/ml)(S5)和103(copies/ml)(S3)样本,评价其精密度。结果 S7、S5、S3的批内精密度CV值分别为2.022%、3.682%、4.469%,总精密度的CV值分别为4.037%、4.452%、7.090%。结论本检测系统的精密度情况符合试剂厂商声明要求,可以满足临床需求。