大鼠脊髓缺血再灌注损伤后caspase-12表达与细胞凋亡

目的:观察大鼠脊髓缺血再灌注损伤过程中细胞凋亡、caspase-12的表达变化规律,以探讨其分子机制。方法:采用自制压迫装置制备脊髓压迫缺血再灌注模型。运用形态学、分子生物学等方法,分别于缺血再灌注后3、7、11、23和47h,观察脊髓缺血再灌注损伤后,脊髓的病理变化和内质网的形态学改变、细胞凋亡及caspase-12的表达变化的规律。结果:脊髓缺血再灌注3h后,出现不同程度的细胞肿胀,神经元退行性变及内质网结构变化;随着再灌注时间的延长,神经元和神经胶质细胞凋亡数明显增加,并伴有caspase-12的表达增强;capspase-12表达与细胞凋亡的时空变化规律相一致。结论:在脊髓缺血再灌注过程中神经细胞凋亡是引起脊髓继发性损伤的主要病理因素,caspase-12可能参与了脊髓缺血再灌注损伤所导致的细胞凋亡。     

人体解剖标本考试评价方法的实践与探索

医学是一门实践性很强的应用学科,医学生动手操作及临床实践能力的高低是评价医学教育质量的重要指标之一。人体解剖学不仅是重要的基础学科,也是基础医学向临床医学过渡的桥梁学科,采用恰当的教学手段提高学生实践和动手能力对于其他基础医学和临床医学课程的学习具有举足轻重的作用，而人体解剖标本的学习和考试是实现这一教学目标极其重要的方式[1]。本文现将人体解剖标本考试评价方法的实践与探索报告如下。     

脑红蛋白在内毒素脑损伤大鼠模型中的表达变化

目的 了解内毒素脑损伤大鼠额叶皮质、脑脊液(CSF)和血清中脑红蛋白(Ngb)的表达变化并分析其意义.方法 选用SD大鼠70只,随机分为对照组10只和内毒素干预组60只.内毒素干预组大鼠于脑池内注射0.1 mg/kg LPS,对照组注入等体积等渗盐水.内毒素干预组大鼠于注射后3、6、12、24、48、72 h收集血清和CSF,并处死大鼠留取额叶皮质,每时相点10只大鼠.应用酶联免疫吸附测定(ELISA)法和蛋白质印迹法测定Ngb含量,干燥法测定额叶皮质含水量;并对各样本中Ngb含量与额叶皮质含水量行相关性分析.采用生物素-链霉亲和素-辣根过氧化物酶(SP)法检测Ngb在额叶皮质中的表达.对照组大鼠亦进行上述检测.结果 ELISA结果 显示,内毒素干预组大鼠注射后各时相点额叶皮质、CSF、血清中Ngb含量高于对照组,其中48 h达峰值[分别为(35.4±3.9)、(22.7±3.1)、(14.4±2.8)ng/mL,P<0.01].蛋白质印迹法显示,各组均表达相对分子质量约为17×103的Ngb蛋白,Ngb表达变化与ELISA检测结果 相似.注射后6～72 h,内毒素干预组大鼠额叶皮质含水量明显高于对照组(P<0.01),其中48 h达峰值(83.3±1.9)%.内毒素干预组大鼠各时相点血清、CSF、额叶皮质Ngb含量与额叶皮质含水量4项指标两两比较,均呈正相关(γ为0.631～0.719,P<0.01).SP法显示.Ngb免疫反应阳性细胞主要位于神经元的细胞质.结论 LPS所致脑损伤中Ngb表达的上调与LPS的注入时间相关.     

蛋白酶体抑制剂对神经细胞nicastrin表达的影响

目的:探讨蛋白酶体抑制剂能否引起神经细胞内nicastrin(NCT)蛋白表达及分布的变化,以明确NCT的蛋白降解是否与蛋白酶体有关。方法:在用人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)建立稳定表达NCT细胞株的基础上,应用蛋白酶体抑制剂处理NCT细胞株,并结合Western blotting、放射性同位素脉冲示踪技术、免疫荧光双标技术,检测蛋白酶体抑制剂处理后神经细胞内NCT的蛋白表达变化。结果:Western blotting结果显示,特异性蛋白酶体抑制剂处理后,神经细胞内源性和外源性转染的NCT的表达显著增强,高度特异的蛋白酶体抑制剂lacta-cystin对NCT蛋白的增强效应呈剂量依赖性和时间依赖性;放射性同位素脉冲示踪结果显示,蛋白酶体抑制剂可显著增强细胞内新合成的NCT蛋白的表达水平,其增强作用是通过阻止[35S]-NCT的蛋白降解来实现的;免疫荧光双标结果提示,NCT与泛素在细胞内共存。结论:神经细胞内NCT的降解由蛋白酶体途径介导;NCT在降解之前经泛素化修饰。     

实验性早期糖尿病大鼠视网膜水通道蛋白4及其mRNA的表达变化

目的:探讨实验性早期糖尿病鼠视网膜水通道蛋白4(AQP4)及其mRNA的表达变化及其意义.方法:用链脲菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射的方法建立大鼠糖尿病模型,运用墨汁灌注实验检测视网膜微血管渗漏情况;用免疫荧光组织化学检测AQP4存视网膜内的分布和表达变化;用原位杂交和RT-PCR检测AQP4 mRNA在视网膜内的分布及表达变化.结果:与同龄正常对照组大鼠相比,早期糖尿病鼠视网膜末见明显血管渗漏现象,但存在部分细胞水肿、节细胞数目减少、感光细胞外节排列紊乱等病理改变;免疫组织化学、原位朵交和RT-PCR结果显示.模型鼠视网膜内AQP4及其mR-NA的表达明显增强.结论:实验性早期糖尿病鼠视网膜.在微血管病变发生前,已存存细胞水肿等病理改变;AQP4及其mRNA的表达明显上调.AQP4表达上调可能是糖尿病早期视网膜水肿形成、视功能下降的重要原因.     

水通道蛋白-4表达变化与急性高眼压视网膜损伤的相关性研究

目的 观察不同高眼压作用下,水通道蛋白-4(AQP4)及其mRNA在大鼠视网膜内的表达变化.以探讨AQP4与眼压异常性疾病的关系.方法 采用前房加压灌注法.分别制作75cm、125cm和150cm水柱不同压力急性高眼压大鼠模型;通过HE和尼氏染色了解视网膜病理改变和神经节细胞数目变化;应用免疫组织化学、免疫荧光双标、原位杂交以及RT-PCR等技术检测不同高眼压作用下,AQP4及其mRNA在视网膜内的表达变化.结果 与对照组相比,各实验组大鼠视网膜晕不同程度水肿样改变,其内层厚度增加,神经节细胞数目明显减少;AQP4及其mRNA在视网膜内的表达明显增强,其表达上调水平与眼压升高程度呈正相关,并与视网膜内层厚度增加以及节细胞数目减少相关(P<0.01).结论 急性高眼压作用下,大鼠视网膜内AQP4及其mRNA的表达明显增强,呈压力依赖性,其异常高表达可能与急性高眼压的病理损伤过程以及眼内水、电解质代谢失衡有关.     

蛋白酶体抑制剂对神经细胞前咽缺陷蛋白-1表达的影响

目的 探讨神经细胞内前咽缺陷蛋白-1(Aph-1)的蛋白降解是经蛋白酶体途径还是经溶酶体途径介导.方法 在人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)建立稳定表达Aph-1细胞株的基础上,应用蛋白酶体和溶酶体酶抑制剂分别处理Aph-1细胞株,并结合Western blotting、放射性同位素脉冲示踪技术(Pulse-chase)、免疫荧光双标等技术,检测细胞内Aph-1的蛋白表达变化.结果 Western blotting结果显示,特异性蛋白酶体抑制剂能显著提高神经细胞内源性和外源性Aph-1的蛋白表达水平,且高度特异的蛋白酶体抑制剂乳胞素(Lactacystin)对Aph-1表达的增强效应呈剂量依赖性和时间依赖性;而非蛋白酶体蛋白酶抑制剂ALLM和溶酶体酶抑制剂对Aph-1的蛋白表达无影响;Pulsechase结果显示,蛋白酶体抑制剂可增强细胞内新合成Aph-1的表达水平,其增强作用是通过阻止35S-Aph-1的蛋白降解实现;免疫荧光双标结果显示,Aph-1与泛素在细胞内共存.结论 神经细胞内Aph-1的蛋白降解由蛋白酶体途径介导,与溶酶体途径无关;Aph-1在降解之前经泛素化修饰.

Abstract：

Objectives To investigate whether degradation of anterior pharynx decfective-1(Aph-1) goes through proteasomal pathway or lysosomal pathway.Methods Various methods such as cell culture,Western blotting,pulse-chase metabolic labeling technique,double immunofluoresecnt staining,combined with proteasomal and lysosomal inhibition were used to check Aph-1 expression level in stable Aph-1-transfected or non-transfected neuronal(SH-SY5Y)cell line.Results Using Western blotting,treating the neuronal cells with proteasome specific inhibitors significantly increased the expression of both endogenous and exogenous Aph-1.The effect of the proteasome inhibitors on Aph-1 expression was dose-and time-dependent Lysosomal pathway was not involved in Aph-1 degradation. Pulse-chase metabolic labeling experiment showed that the turnover of newly-synthesized radiolabeled Aph-1 protein was blocked by Lactacystin.Double immunofluorescent staining revealed colocalization of Aph-1 and ubiquitin in the same cells.Conclusion Degradation of Aph-1 protein is mediated by proteasomal pathway in neuronal cells,and is not related to lysosomal pathway.Aph-1 protein is ubiquitinated before degradation.     

电针对大鼠脊髓压迫性损伤后髓鞘再生的影响

目的观察电针对大鼠脊髓压迫性损伤（CSCI）后DNA结合抑制物2(Id2)和髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达变化,探讨髓鞘再生的机制。 方法将54只SD大鼠分为对照组和治疗组,每组27只,再根据取材时间点的不同各分为3 d、7 d和14 d三个亚组,每个亚组9只大鼠。治疗组采用自行设计的大鼠脊髓压通器制作脊髓压通性损伤模型,针刺脊髓损伤节段局部夹脊穴、双侧足三里和双侧太溪穴,并于双侧足三里和太溪穴进行电针刺激（连续波,输出频率为2 Hz,电压1.5 V,30 min）。对照组只造模,不治疗。2组大鼠均于对应时间点取材,运用电镜观察脊髓损伤节段髓鞘的超微结构;采用免疫印迹技术和免疫荧光双标从分子水平检测Id2及MBP的表达变化。 结果CSCI后,荧光双标结果显示,造模后第3天,对照组大鼠的Id2免疫阳性少突胶质细胞数目为（20±2）个/高倍镜视野,并在造模后第14天下降至（16±1）个/高倍镜视野,组内各时间点Id2免疫阳性少突胶质细胞数目比较,差异无统计学意义（P&rt;0.05）。造模后第3天,治疗组大鼠Id2免疫阳性少突胶质细胞为（13±1）个/高倍镜视野,造模后第14天降至（7±1）个/高倍镜视野,组内各时间点Id2免疫阳性少突胶质细胞数目比较,差异有统计学意义（P<0.05）,并与同时间点的对照组比较,差异亦有统计学意义（P<0.05）。Western结果显示,造模后第3天,对照组和治疗组Id2蛋白表达分别为（1.12±0.12）和（0.67±0.01）,造模后第14天,对照组和治疗组Id2蛋白表达分别下降至（0.86±0.02）和（0.25±0.01）,与组内造模后第3天比较,差异均有统计学意义（P<0.05）,2组相同时间点Id2蛋白表达组间比较,差异有统计学意义（P<0.05）。造模后第3天,对照组和治疗组的MBP蛋白表达分别为（0.44±0.02）和（0.67±0.04）,造模后第14天,对照组和治疗组MBP蛋白表达均分别上调至（0.95±0.04）和（1.74±0.09）,与组内造模后第3天比较,差异均有统计学意义（P<0.05）,2组相同时间点的MBP蛋白表达比较,差异有统计学意义（P<0.05）。 结论电针刺激可调节Id2的表达从而负向调控MBP的表达。