广西莱姆病螺旋体5s-23srRNA间隔区基因的克隆和序列分析

目的：对广西莱姆病螺旋体分离株基因型鉴定。方法：应用聚合酶链反应从3株广西莱杂病螺旋体及1株贵州分离株全基因组DNA中将5S－23SrRNA间隔区基因调出，并克隆至质粒PGEM－T中，构建重组质粒，测序后与国外其它分离株进行同源性比较。结果：4例莱杂病螺旋体均扩增出约242bp的5s-23srRNA间隔区基因，同源性99％以上，与B.valaisiana基因型的同源性均比其他基因型高，同源性97．1％－97．9％。结论：4莱姆病螺旋体均属于B.valaisiana基因型，此基因型在为我国为首次报道。     

甲型肝炎病毒P1B、P2A、P3AB和P3D蛋白在原核系统中的表达和抗原活性分析

目的研究甲型肝炎病毒P1B、P2A、P3AB和P3D在原核系统中的表达,并探讨这些蛋白的抗原活性和作为诊断抗原的应用价值。方法采用PCR方法,从克隆有HAV HM175株全长cDNA基因的克隆载体pHAV16H1上扩增出目的基因,以M47作为表达载体,构建N端带硫氧还蛋白的重组表达质粒。重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达。采用DEAE阴离子交换和镍离子柱螯和亲和层析纯化的方法对重组蛋白进行纯化。以Western Blot和间接ELISA的方法检测重组蛋白的抗原活性。结果四个重组质粒经测序证明构建正确无误,在大肠埃希菌中表达四个蛋白的相对分子质量也正确无误。Western Blot分析和间接ELISA方法证实四个蛋白中只有p2a有抗原活性。结论原核表达的P2a蛋白,具有较好的抗原活性,在间接ELISA方法中检测出了所有的24份阳性血清和24份阴性血清,非常有希望做成诊断抗原用于诊断急性甲肝患者和区分甲型肝炎自然感染与注射疫苗所产生的不同免疫。     

丙型肝炎病毒基因组部分E2／NS1蛋白基因在大肠杆…

在大肠杆菌中表达了丙型肝炎病毒基因组的部分Ｅ２／ＮＳ１蛋白（氨基酸３６４－５１２）。表达蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，主要表达带的分子量在－４３ ０００左右。表达蛋白用于检测已用Ｃ３３ｃ及Ｃ２２检测过的血清，发现Ｅ２ ＮＳＩ抗体阳性率占Ｃ３３ｃ及Ｃ２２抗体阳性血清的２０％，尚没有发现单独Ｅ２／ＥＳＩ抗体阳性的血清。     

无症状HBV携带者外周血CD4~+TCR Vβ基因亚家族克隆化特征的研究

分析无症状HBV携带者(AsC)CD4+TCR Vβ基因家族克隆化特征。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增7例AsC外周血CD4+TCR Vβ基因22个亚家族的CDR3区,基因扫描技术对CD4+TCR Vβ亚家族的克隆化进行鉴定。结果基因扫描显示,7例AsC CD4+TCR Vβ基因亚家族均出现一个或一个以上单克隆或寡克隆增生;7例健康者CD4+TCR Vβ基因亚家族均呈正态分布。提示,AsC外周血CD4+TCR Vβ亚家族存在克隆性增生,这可能与AsC免疫耐受的形成有关。     

诊断用丁肝抗原的基因优化及其蛋白表达、纯化和鉴定

目的 获取有生物活性的丁肝抗原蛋白,探讨其作为诊断试剂的应用价值.方法 经密码子优化,合成人工编码的丁肝抗原基因序列;以M48作为表达载体,构建带有硫氧还蛋白的重组表达质粒;在大肠埃希氏菌中经IPTG诱导表达;以亲和层析纯化并以ELISA鉴定该蛋白.结果 酶切鉴定构建的质粒正确;SDS-PAGE结果显示表达和纯化的外源蛋白与预期相对分子质量大小一致;ELISA鉴定该蛋白有与丁肝抗体特异性结合的活性.结论 成功获得有生物活性的可供诊断用的丁肝抗原蛋白,为丁肝诊断试剂的研发奠定了基础.     

丙型肝炎病毒亚单位融合蛋白的表达及免疫原性测定

目的获得高纯度的丙型肝炎亚单位融合蛋白并评价其免疫原性。方法利用原核表达系统,以pET—11d作为载体,在大肠埃希菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达获得融合蛋白,之后采用DEAE阴离子交换和镍离子柱亲和层析进行纯化。通过Western Blot验证融合蛋白的抗原活性。同时以该蛋白免疫实验动物后测定血清中的抗体滴度。结果成功获得很高纯度的丙型肝炎亚单位融合蛋白,EIA显示融合蛋白能够诱生出高滴度的抗体。结论原核表达系统表达的丙型肝炎病毒亚单位融合蛋白具有较强的免疫原性,为丙型肝炎病毒治疗性和预防性疫苗的研制提供了一条新的途径。     

四川省遂宁市2009年乙型病毒性肝炎血清流行病学调查

目的 了解四川遂宁市乙肝病毒感染状况,评价遂宁市从1992年在新生儿中推广乙肝疫苗免疫策略的效果.方法 采用多阶段分层随机抽样的方法,按行政区域和经济水平随机抽取6个调查点（村、县）,以家庭为单位对全部人群采集外周静脉血,用酶联免疫吸附实验法（ELISA）检测HBsAg、抗-HBs、和抗-HBc.结果 共采集1468人血清进行检测,人群中HBsAg阳性率为14.78%、抗-HBs阳性率为39.17%、HBV感染率72.68%.HBsAg阳性率最高年龄组为30～34岁组（27.59%）,最低为0～4岁组（2.06%）;HBV感染率最高的是55～59岁组（93.13%）,最低是5～9岁组（44.2%）;性别、年龄、职业、地域HBV感染标志流行率均存在差异.结论 四川遂宁地区人群HBV感染率较高,人群HBsAg阳性率仍高于全国平均水平,但人群中乙肝流行病学特征已经发生了改变,乙肝疫苗的接种推广使用,已经显著降低了目标人群（≤14岁人群）的HBsAg阳性率和HBV感染率.     

中国部分甲肝病毒流行株结构蛋白VP3-VP1区基因特点分析

目的 分析中国部分甲肝病毒流行株结构蛋白VP3-VP1区基因特点.方法 收集42份甲肝患者急性期血清标本,经核酸提取、逆转录及巢氏PCR,测得结构-非结构蛋白VP3-VP1-2A区序列,进行序列同源性比较并分析其基因特点.结果 42株HAV病毒株在VP1-2A连接处核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.1%～100%和97.3%～100%;在全长结构蛋白VP3-VP1区的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为87.6%～100%和98.8%～100%.VP1-2A连接处序列相同的病毒株在全长结构蛋白VP3-VP1区的核苷酸同源性为98.4%～100%,0～2个氨基酸位点不同.本实验所得序列在中和抗原位点处氨基酸序列均未变异.结论 42株病毒株均属于I型,40株是IA亚型,2株IB亚型.本实验所用HAV流行株在结构蛋白VP3-VP1区的核苷酸存在差异但是氨基酸序列高度保守且没有中和抗原位点处的变异.VP1-2A结合处核苷酸序列相同的分离株在全长结构蛋白VP3-VP1区核苷酸序列相同或相近,氨基酸序列保守.     

乙型肝炎病毒表面抗原基因点突变对HBsAg抗原性的影响

目的 研究乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)常见基因点突变对HBsAg抗原性的影响,了解我国目前常用的HBsAg检测试剂对HBV S基因突变株的检测灵敏性,减少漏检,有效控制乙肝病毒(HBV)感染的传播.方法 构建HBsAg重组野毒株和重组变异株表达质粒,分别将重组野毒株HBsAg表达质粒pSS1adw2及pSS1adr和重组变异株HBsAg表达质粒pSS1adw2-145Arg、pSS1adr-126 Ser和pSS1adr-126 Asn转染COS-7细胞,进行瞬时转染.采用市售HBsAg ELISA检测试剂盒对细胞上清进行抗原性检测.结果 野毒株HBsAg和两种126位变异株HBsAg具有较好的抗原性;145位点突变后、导致HBsAg的抗原性下降.结论 推测是由于145位点变异影响了"a"抗原决定簇的空间结构,从而降低了其与抗-HBs的结合能力.     

丁型肝炎病毒抗原的原核表达及抗原性分析

目的 利用含T7启动子和His纯化标签pRSET B质粒构建丁型肝炎病毒抗原（HDAg）重组表达质粒（pRSETB-HDAg）,转化宿主菌,表达并纯化,获得生物活性高抗原性强的基因工程重组抗原.方法 将中国河南株HDAg基因片段插入pRSET B表达质粒,转化BL21宿主菌,经IPTG诱导表达.表达产物经Chelating亲和层析纯化后,采用EIA方法分析HDAg的抗原性.结果 重组HDAg稀释1000倍（10 ng/ml）仍与抗体有较强的反应.经与美国HDAg和华美公司生产的HDV诊断试剂同时检测26份HDV阳性参比血清,三者结果比较,除美国抗原漏检1份,检出率为96.15%（25/26份）外,病毒CDC和华美试剂均无漏检,检出率为100%,三者检测结果具有很高的符合率.结论 成功构建了丁型肝炎病毒抗原重组表达质粒（pRSETB-HDAg）,在原核细胞获得稳定高效表达,EIA 检测证明HDAg抗原性好,可用于组装HDV诊断试剂,用于临床丁型肝炎患者的诊断和我国丁型肝炎病毒感染流行病学的调查.