重组人中期因子的原核表达、纯化及生物学活性鉴定

目的：表达和纯化具有生物学活性的重组人中期因子蛋白。方法：应用RT—PCR从人肝细胞癌组织总RNA中扩增中期因子cDNA,将其克隆到表达载体pET-24a,在大肠杆菌中诱导表达,经肝素-琼脂糖亲和层析柱纯化,应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western印迹和细胞增殖试验对纯化产物进行分析鉴定。结果：构建的重组质粒pET—HMK能在大肠杆菌中高表达,诱导表达的蛋白主要存在于包涵体中,经肝素琼脂糖柱亲和层析后纯化产物呈单一条带,特异性抗体反应证实是重组人中期因子,细胞增殖试验显示其能育效促进NIH3T3细胞生长,并且具有剂量依赖性。结论：原核系统表达的重组人中期因子蛋白纯品具有刺激细胞增殖的活性。     

快速大容量尾静脉注射法构建循环肝癌细胞肝转移小鼠模型

目的： 通过快速大容量尾静脉注射方法构建循环肝癌细胞肝内复发转移小鼠模型。 方法： 40只C57BL/6J小鼠采用随机数字表法随机分为对照组和实验组（20只/组）,对照组采用传统的缓慢小容量尾静脉注射法（2×10 6个肝癌Hepa1-6细胞/0.2 ml,30 s内注射完毕）,实验组采用改良的快速大容量尾静脉注射法（2×10 6个肝癌Hepa1-6细胞/2 ml,5 s内注射完毕）构建循环肝癌细胞肝内复发转移小鼠模型。4周后摘取肝、肺、肾、脾组织并行H-E染色,大体和镜下观察肝脏、肺脏、脾脏和肾脏的成瘤情况。 结果： 对照组小鼠只在肺脏有转移灶形成,成瘤率为95%（19/20）,肝脏、肾脏、脾脏未见有转移灶形成。实验组小鼠在肝脏和肺脏同时形成转移灶,肺脏成瘤率为94.7%（18/19）,肝脏成瘤率为100%（19/19）,脾脏、肾脏未见转移灶形成。 结论： 快速大容量尾静脉注射法注射循环肝癌细胞构建的小鼠模型可以模拟肝癌根治性切除后残留的循环肝癌细胞导致早期肝癌肝内复发转移的过程。     

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近年来 ,随着分子生物学、细胞生物学和人类基因组学等基础学科向肝癌研究领域的渗透 ,肝癌分子诊断研究取得了长足的进展 ,一方面 ,以甲胎蛋白 (ＡＦＰ)、异常凝血酶原为代表的一些行之有效的肝癌蛋白类标志物一直被临床沿用并得到进一步研究 ,另一方面 ,肝癌基因类标志物研究日新月异 ,其基因诊断手段也正在逐步向临床过渡。1　肝癌蛋白类标志物1 1　ＡＦＰ变异体ＡＦＰ是一个人们熟知的肝细胞癌 (ＨＣＣ)标志物 ,在临床上的应用价值早已为世界公认。然而 ,由于部分肝炎、肝硬化等良性肝病ＡＦＰ亦升高 ,常使临床医生在判断结果时颇感棘手…     

mda-7/IL-24通过内质网应激通路诱导肝癌细胞生长抑制和凋亡

目的:观察mda-7/IL-24对不同类型的肝肿瘤细胞及正常肝脏细胞增殖及凋亡的影响并探讨其可能的作用机制.方法:构建携带mda-7基因的重组腺病毒Ad-mda-7,转染肝癌细胞系HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5和正常肝细胞L02,MTT法和流式细胞术检测细胞增殖及凋亡情况,Western印迹检测细胞相关蛋白的表达.应用钙蛋白酶抑制剂Ⅰ (ALLN,25 μmol/L)预处理上述细胞30 min,观察阻断内质网应激通路后上述指标的变化.结果:MTT法和流式细胞术检测结果表明,与感染Ad-GFP比较,Ad-mda-7选择性抑制肝癌细胞生长(P<0.01),诱导肝癌细胞凋亡(P<0.01,其中对HepG2细胞影响最明显),而对正常肝细胞生长无明显影响;ALLN预处理能部分抑制Ad-mda-7的上述作用.Western印迹结果表明Ad-mda-7 能诱导HepG2细胞BiP/GRP78、Bax蛋白高表达(P<0.01),caspase-12、caspase-3活化及p38 MAPK磷酸化;ALLN预处理能抑制Ad-mda-7转染引起的Bax蛋白高表达及caspase-12、caspase-3活化;而对BiP/GRP78的高表达及p38 MAPK磷酸化无影响.结论:mda-7/IL-24可能通过内质网应激通路诱导肝癌细胞生长抑制和凋亡.     

凝集素辛和电泳—免疫印迹法检测甲胎蛋白变异体

甲胎蛋白 (ＡＦＰ)是一个公认的肝细胞癌 (ＨＣＣ)标记物。然而 ,部分慢性肝炎、肝硬化等良性肝病亦可合成少量ＡＦＰ。由于糖基化过程的差异 ,不同疾病状况下肝细胞分泌的ＡＦＰ在糖链结构上并不相同。为了鉴别ＡＦＰ是产生于恶性肝癌细胞还是良性肝病细胞 ,人们已建立多种ＡＦＰ糖链变异体测定方法。新近的报告表明 ,ＡＦＰ糖链变异体测定还有助于ＨＣＣ复发转移的监测和预后的判断[1,2 ] 。我们在已建立的凝集素亲和免疫电泳自显影法[3 ] 的基础上 ,又建立了操作更简便、敏感度更高的凝集素亲和电泳 免疫印迹法 ,并初步用于良恶性肝病的…     

腺病毒介导的KDR启动子-胸苷激酶系统对血管内皮细胞的选择性杀伤作用

目的研究腺病毒介导的KDR启动子-胸苷激酶系统对血管内皮细胞的选择性杀伤作用.方法应用PCR克隆出人KDR基因启动子序列-225 bp～+127 bp,以AdEasy system为载体,构建携带受KDR启动子或CMV启动子调控tk基因表达的2种重组腺病毒质粒pAdKDR-tk和pAdCMV-tk,在293细胞中包装、扩增后,体外感染表达KDR的脐静脉血管内皮细胞系HUVEC和不表达KDR的肝癌细胞系HepG2,并给予不同浓度的丙氧鸟苷(GCV)处理,5 d后收集存活细胞并计数.结果产生的病毒滴度均为5×109pfu/ml.在MOI为100、GCV为50μg/ml条件下,AdKDR-tk转染HUVEC后细胞生存率下降(31.49%±6.42%),AdKDR-tk转染HepG2后细胞生存率为76.57%±3.49%,而转染AdCMV-tk的2细胞系生存率均显著下降,细胞生存率分别为22.24%±3.77%(HUVEC)和26.53%±6.84%(HepG2).结论KDR基因启动子可调控HSV-tk在血管内皮细胞中特异性表达,为进一步开展靶向肿瘤血管内皮的自杀基因治疗研究奠定了基础.     

外周血循环中肿瘤细胞检测的临床意义与研究现状

越来越多的资料表明,恶性实体瘤的复发转移主要是通过淋巴及血液系统播散。癌细胞从原发部位侵入血管或淋巴管,在循环中播散并存活,之后循环的肿瘤细胞(circulatingtumor cell,CTC)落户到其它部位或器官继续生长,形成转移灶。在文献中,有时将微转移作为CTC的代名词。严格来说,这是不准确的,两个词定义侵袭过程中的不同阶段。CTC是指侵袭或非侵袭的肿瘤细胞自发或因诊疗操作进入外周血循环。在导致肿瘤转移的一系列连续事件中,肿瘤细胞进入循环较早于微转移形成。后者起因于CTC在外周组织中渗出并生长,它们可能以一种休眠状态沉默一段长短不等的时间,并在一定的条件下发展成为临床可发现的转移。     

豌豆凝集素的分离纯化及性质鉴定

豌豆凝集素(Pisum sativum agglutinin,PSA)是从豌豆中提纯的一种植物凝集素。它与细胞表面受体及与可溶性糖蛋白和糖脂间的反应性、使其成为研究细胞生物学特性,尤其是研究糖类复合物的常用生化试剂之一。新近我们发现,应用     

活化型肝星状细胞清除机制及其相关抗肝纤维化策略

已知肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)活化是肝纤维化的核心环节。越来越多的基础和临床研究证实,肝纤维化可以逆转。而肝纤维化消退的主要表现之一是活化型HSCs数量不断减少。因此,如何清除活化型HSCs并使之成为抗肝纤维化治疗新策略正逐渐受到关注。现有两种可能机制用于解释活化型HSCs的清除现象,即活化型HSCs的表型逆转和凋亡。本文旨在对基于活化型HSCs清除机制的抗肝纤维化策略进展做一综述。