转基因修饰后的自体骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠后成肌调节因子的表达研究

目的探讨携带micro-dystrophin基因的自体骨髓间充质干细胞移植入mdx鼠后在移植鼠体内分化为肌细胞的可能机制。方法采用逆转录病毒介导micro-dystrophin基因转染mdx小鼠MSCs（mMSCs）,通过尾静脉注射移植治疗mdx鼠,在移植后免疫荧光检测micro-dystrophin的表达并在不同时间点检测MyoD的表达。结果移植后成功检测到micro-dystrophin,其表达随着移植时间的延长而增加;随移植时间延长MyoD阳性肌纤维比例增加,分别达到9%（4周时）、15%（8周时）、28%（12周时）。RT-PCR和Westernblot也发现,随着移植时间的延长,MyoD表达增加。结论自体mMSCs可携带外源性micro-dystrophin基因在受体鼠体内分化为micro-dystrophin阳性肌细胞,移植入的干细胞向肌细胞的分化是一个持久的、连续的过程,成肌调节因子在调节其分化过程中发挥了重大作用。     

WilSon病蛋白及其基因在肝豆状核变性患者中的改变

目的探讨肝豆状核变性(WD)发病的分子生物学机制.方法通过外科手术获得3例WD患者、2例对照者的肝活检标本,利用胶原酶温育消化法分离肝细胞,并进行体外原代培养;肝细胞裂解离心后,使用6%聚丙烯酰胺凝胶行SDS-PAGE电泳,分离WD蛋白;以抗人WD蛋白抗体为第一抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体为第二抗体,对肝细胞WD蛋白进行Westem-blot印迹检测,观察特异性条带数目、密度深浅和分子量大小;同时采用荧光PCR技术,筛查所有研究对象WD基因8号外显子(exon 8)的突变情况,对异常者进行DNA直接测序结果 WD患者及对照者肝细胞WD蛋白Westem-blot检测均表现为特异的155kDa条带,3例WD患者中1例无明显变化,另2例出现155kDa条带密度降低,仅有对照组密度的1/3～1/2,提示这两例患者的WD蛋白在肝内表达异常;荧光PCR筛查发现1例患者存在exon 8 Arg778 Leu突变,DNA直接测序证实为2273G→TG杂合突变.结论 WD基因蛋白产物在WD患者肝细胞的表达存在异常,这可能与WD基因Arg778Leu位点突变有关,直接检测WD基因蛋白产物有助于研究WD的发病机制.     

时间分辨荧光免疫分析法和免疫放射分析法检测HBsAg的对比分析

HBsAg存在于HBV的外壳部分,是乙型肝炎的早期诊断指标之一。绝大多数HBV感染者外周血出现HBsAg。我们用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)法和免疫放射分析(IRMA)法对400份临床血清标本以及定值血清进行了HBsAg对比检测,现报道如下。材料与方法1材料血清:受检标本为广州邮电医院检验科收集的各类患者血清,检测前的标本保存于-20℃。adr亚型浓度为0.2μg/L、1.0μg/L定值血清,购自中国药品生物制品检定所。稀释用小牛血清购自郑州佰安生物有限公司。试剂:TRFIA定量检测试剂盒为广州市丰华生物工程有限公司和中山生物有限公司联合研制…     

pVAX1-microdystrophin重组质粒的构建及其治疗Duchenne型肌营养不良症的初步研究

目的 构建含有人microdystrophin基因的重组质粒,体内、外研究其表达,为进一步应用此重组质粒来研究电转、静脉、动脉注射或加入其它基因来增强microdystrophin基因的表达等方法对Duchenne型肌营养不良(Duchenile muscular dystrohy,DMD)进行基因治疗奠定基础.方法 用Not Ⅰ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因.片段回收后定向插入真核表达质粒pVAX1,获得重组质粒pAMICDYS.然后将重组质粒pAMICDYS转染小鼠成纤维细胞3T3细胞,通过逆转录-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达;最后将重组质粒pAMICDYS通过肌肉注射到DMD模型鼠胫前肌中,检测治疗肌肉的病理变化和microdystrophin的表达情况.结果 成功构建了含有microdystrophin基因的重组质粒,并在体外得到了很好表达,体内研究表明microdystrophin基因在mdx鼠TA也有一定程度的表达,而且减少了所治疗肌肉的核中移数量,证实了其对mdx鼠有一定的治疗作用.结论 该重组质粒的构建及体内、外得到成功表达,为下一步用该质粒进行电转、静脉、动脉注射或加入其它基因来增强microdystrophin基因的表达来治疗DMD疾病奠定了基础.     

Micro-dystrophin基因修饰的MSCs在mdx小鼠体内分化为肌卫星细胞的研究

目的：探讨携带抗肌萎缩蛋白小基因（Micro-dystrophin）的自体骨髓间质干细胞（MSCs）在Duchenne型肌营养不良症（DMD）模型鼠（mdx小鼠）体内分化为肌卫星细胞的潜能。方法：采用逆转录病毒介导micro—dystrophin基因转染mdx小鼠MSCs,通过尾静脉注射移植治疗mdx小鼠,移植后12周免疫荧光法检测受体鼠腓肠肌micro-dystrophin的表达,并分离培养肌卫星细胞进行鉴定。结果：受体鼠腓肠肌成功检测到micro-dystrophin表达;分离培养肌卫星细胞发现部分细胞可同时表达micro—dystropbin和c—met及micro—dystrophin和desmin。结论：自体mdx小鼠MSCs可携带外源性micro—dystrophin基因,并在体内分化为micro—dystrophin阳性肌细胞,少数细胞可作为肌卫星细胞长期存在。     

PCR荧光定量检测HBV—DNA与其血清学标志物检测的对比分析

HBV感染时，外周血中HBV－DNA是病毒复制活动最直接和可靠的标志，而最新发展起来的PCR荧光定量检测技术以其灵敏度高、特异性好、结果准确可靠而在HBV－DNA的定量检测中迅速得到了广泛应用，为临床乙型肝炎的动态研究提供了很好的参考数据犤１犦。与此同时，ELISA作为HBV临床诊断的常规方法，其检测结果为人体对HBV的免疫状态提供了很好的说明。这两种作为检测乙型肝炎的主要方法，在临床应用上互有弊益，不能相互替代。为了进一步阐明两种方法在临床诊断上的诊断意义以及HBV－DNA与其血清标志物的关系，我们对临床送检的３…     

骨髓干细胞移植后Western blot免疫印迹分析鼠抗肌萎缩蛋白表达的变化

目的:Western blot免疫印迹分析骨髓干细胞移植后mdx鼠抗肌萎缩蛋白表达的变化。方法:实验于2004-09/12在中山大学附属第一医院神经科实验室完成。①选取7～8周龄mdx鼠25只,随机数字表法分为骨髓移植4,8,12,16周组、空白对照组,5只/组。另选取4～6周龄C57鼠20只作为供体鼠,10周龄C57鼠5只作为阳性对照组。②各组在移植前均给予照射剂量为7Gy的放疗预处理。放疗完毕后,骨髓移植4,8,12,16周组均进行尾静脉细胞移植,移植细胞数为2×107/只,0.3～0.5mL;空白对照组、阳性对照组尾静脉输入0.3mL磷酸盐缓冲液。③骨髓移植4,8,12,16周组分别于对应时间点处死,取其腓肠肌,制备抗肌萎缩蛋白样品,进行抗肌萎缩蛋白Western blot免疫印迹分析,以GAPDH作为内参。结果:25只7～8周龄mdx鼠、5只10周龄C57鼠全部进入结果分析。骨髓干细胞移植后抗肌萎缩蛋白Western Blot免疫印迹分析结果:空白对照组无抗肌萎缩蛋白的表达;骨髓移植4周组仅可见抗肌萎缩蛋白的微弱表达,dystrophin/GAPDH灰度比值约为0.095±0.267;骨髓移植12周组约为0.218±0.338;随骨髓移植时间的延长抗肌萎缩蛋白表达量逐渐增加,移植后16周的表达量较移植后8周明显增加(0.393±0.385,0.173±0.284;t=6.062,P<0.05),但仍明显低于阳性对照组1.172±0.328(t=3.14,P<0.05)。结论:骨髓干细胞移植mdx鼠后应用WesternBlot免疫印迹分析可于不同时间检测到抗肌萎缩蛋白的表达,且随移植时间延长表达量增多,提示骨髓干细胞移植可长久持续参与受损骨骼肌的修复与再生。     

CM-Dil标记大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性探讨

BACKGROUND:Existing evidence has shown that CM-Dil-labeled mesenchymal stem cells have delivered better results in experiments in vivo and in vitro. OBJECTIVE:To investigate the effect of in vitro CM-Dil labeling on biological characteristics and directed migration of rat bone marrow mesenchymal stem cells. METHODS:Mesenchymal stem cells were isolated and cultured from the bone marrow of Sprague-Dawley rats. The specific surface antigens, CD29, CD44, CD11b, CD45, were detected by flow cytometry. The rat bone marrow mesenchymal stem cells were labeled with CM-Dil, and then were cultured and passed continually. Thereafter the morphology and proliferation ability of labeled cells were assessed. The strength and duration of fluorescence after CM-Dil labeling were detected. Transwell chambers were used to investigate the migration ability of labeled cells towards the homogenate of the gastrocnemius muscles of mdx mice. RESULTS AND CONCLUSION:The cultured cells were markedly positive for CD29 and CD44, but negative for CD11b and CD45, which were in accordance with the features of bone marrow mesenchymal stem cells. CM-Dil-labeled cells were not different from unlabeled cells in the aspect of morphology and proliferation. Fluorescence was still visible after passage; however, a reduction in fluorescent intensity was observed under an inverted fluorescent contrast phase microscope after labeling. The labeled cells showed no different migration ability from the unlabeled cells (P > 0.05). In conclusion, the procedure of CM-Dil labeling is safe, simple and effective. CM-Dil could be a good choice for labeling and tracing rat bone marrow mesenchymal stem cells.     

血红蛋白Constant Spring的表型与基因型分析

目的 分析血红蛋白Constant Spring(hemoglobin Constant Spring,HbCS)携带者基因型和表现型的关系,探讨HbCS对血液学指标的影响规律.方法 检测HbCS携带者的血常规和血红蛋白电泳.采用跨越断裂点-PCR、反向点杂交方法确认α-、β-地中海贫血(以下简称地贫)突变.结果 HbCS合并--SEA/αα或HbQS表现为HbH病的特征,与αCSα/-α或HbCS杂合子比较,差异有显著的统计学意义.αCSα/-α与HbCS杂合子对表型的影响较小.HbCS合并β地中海贫血,其血液学表型表现为β地贫的特征.上述各型变异阳性病例中,仅有57.6%的样品血红蛋白电泳检测为阳性结果.结论 HbCS杂合子与其它类型地贫突变合并存在时,不同基因型组合可出现较大差异的表型变化.另外,对此类复合地贫仅用血红蛋白电泳较易漏诊和误诊,对其确诊需要依赖基因型分析.     

G6PD缺乏症发病的分子病理学新机制

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(gluocose-6-phosphate dehydrogenase deficiency,简称G6PD缺乏症)是人类最常见的酶缺陷遗传病之一,全球约有4亿多人受累.G6 PD缺乏症主要是由于G6PD基因发生变异所引起,其经典分子病理学机制研究主要集中在G6PD基因的突变研究上,但对少部分病例来说,经典的发病机制并不能对其表型和基因型的关系作出合理的解释.近些年来,一些学者在G6PD缺乏症发病新的分子机制方面作了较为深入的研究,为了更好的理解本病,该文就近年来对于G6PD缺乏症发病的分子病理学新机制的研究作一综述.