原代培养小鼠关节软骨细胞的分化与诱导

背景:传统培养方法体外培养的软骨细胞经长时间传代培养后往往去分化为成纤维细胞,导致细胞数量及活性下降.如何避免培养过程中的去分化问题,是模拟体内软骨内成骨软骨发育过程的关键.目的:课题创新性提出以Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶结合消化法体外培养扩增C57BL/6小鼠关节软骨细胞并诱导其向更成熟肥大软骨细胞或终末分化软骨细胞分化.设计、时间及地点:细胞学体外观察实验,于2008-09/12在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成.材料:C57BL/6品系新生小鼠9只.方法:采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶结合消化法分离培养C57BL/6新生小鼠关节软骨细胞,细胞计数法绘制细胞生长曲线,RT-PCR检测Ⅱ型胶原进行鉴定.当细胞90%融合时以含5.5mg/L人转铁蛋白,3×10<'-8> mol/L亚硒酸钠,10mg/L牛胰岛素的ITS诱导培养基进行分化诱导.主要观察指标:诱导0,7 d,阿利新蓝染色检测软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖,von Kossa染色检测软骨细胞钙化结节形成情况,实时定量PCR检测Ⅱ型胶原、X型胶原及基质金属蛋白酶13的表达进行鉴定.结果:原代培养细胞24 h贴壁,呈三角或多角形,培养4～6 d进入快速增殖期,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原的表达,证实获得大量高纯度、高活性的软骨细胞.诱导0 d,细胞单层铺满培养皿底面,无聚集现象;诱导7 d明显可见由软骨细胞聚集形成的软骨小结.与诱导0 d时相比,诱导7 d阿利新蓝染色示软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖染色呈阳性,可见明显的软骨小结,Ⅱ型胶原及基质金属蛋白酶13表达明显增高,且钙化结节明显增多.结论:采用胰蛋白酶和胶原酶结合消化法获得大量高纯度、高活性的软骨细胞.ITS诱导体系有效地促进了软骨细胞成熟及终末分化,较成功模拟了软骨内成骨的软骨发育过程.     

FGFR2条件性敲除载体的构建及中靶ES细胞的筛选与鉴定

目的　构建成纤维细胞生长因子2型受体(Fibroblastgrowthfactorreceptor 2,FGFR2)条件性敲除载体,并对中 靶ES细胞进行筛选与鉴定,为最终建立FGFR2条件性敲除小鼠模型,研究FGFR2在小鼠骨骼、肺脏等组织、器官发育过程 中的作用打下基础。方法　在分析小鼠FGFR2基因组DNA序列结构的基础上,设计并构建了条件性敲除小鼠FGFR2外 显子7、8的基因打靶载体,采用电穿孔法在ES细胞中进行了打靶重组,G418与Ganciclovir被用于对电转的ES细胞进行正 负筛选,最后对ES细胞克隆进行了Southern与PCR鉴定。结果　将所构建的条件性打靶载体通过电穿孔转染入表达重组 酶(Cre)的AmI细菌,经PCR、酶切和测序鉴定,Cre酶能正确将条件性打靶载体的外显子7、8和选择性标记Neo基因经重 组剔除,电转了基因敲除载体的ES细胞经正负筛选后共挑取克隆83个;经5′端探针Southern杂交鉴定,发现4株阳性克 隆;该4株克隆再经3′端探针Southern杂交鉴定,发现2株阳性克隆;最后经Southern和PCR检测发现1株ES细胞克隆仍 保留外显子7、8两侧的loxP序列。结论　FGFR2条件性基因敲除ES细胞已成功构建。     

小鼠关节软骨表层细胞分离培养及鉴定

目的分离培养小鼠关节软骨表层细胞(ACSC)并鉴定其干细胞特性。方法运用纤连蛋白黏附法从3~5 d新生小鼠膝关节软骨表层分离细胞及培养,对分离细胞以流式细胞仪检测干细胞表面阳性标志物(CD44与CD90)和阴性标志物(CD45、CD31与CD34)的表达;实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检测相关基因表达;单克隆形成实验检测克隆形成能力。三系诱导分化(成软骨、成骨与成脂分化)检测分离培养细胞的多向分化潜能。取第6代分离培养细胞做裸鼠皮下移植实验,检测其体内成软骨能力。结果纤连蛋白可以特异性地黏附ACSC,ACSC形态偏长,类似成纤维细胞。ACSC高表达CD44和CD90,但几乎不表达CD31、CD34和CD45。qRT-PCR检测结果显示,以ACSC表达的mRNA水平为1,则软骨细胞显著性低水平表达间充质干细胞标志物CD73(0.08±0.07,P0.001)、CD90(0.07±0.01,P0.001)、CD105(0.37±0.02,P0.001)和软骨表层细胞标志物Prg4(0.42±0.01,P0.001)、Erg(0.61±0.02,P0.001)、Ten C(0.64±0.07,P0.001),但显著性高水平表达软骨细胞标志物Col2(6.89±0.06,P0.001)、Acan(6.51±0.04,P0.001)、MATN1(14.57±4.21,P0.01)。经过14 d培养,单个ACSC可以形成大于50个细胞的单克隆细胞团。体外诱导ACSC具备很强的成软骨、成骨与成脂分化能力,裸鼠体内ACSC具有成软骨能力。结论小鼠ACSC具有典型的干细胞特征。     

制作小鼠骨骼标本的新方法

目的 改进小鼠骨骼标本的制作方法.方法 利用蚂蚁啃食肌肉和软组织,并结合传统方法制作小鼠骨架.结果 所制作的小鼠骨架完整洁净,没有骨质损伤.结论 利用蚂蚁制作骨架简便快速,优于传统方法,值得推广应用.     

Apert综合征模型小鼠下颌骨形态特点的定量分析

缩小具有统计学差异(P<0.05),主要表现在冠状突和下颌角缩小并沿前后方向向前缩进,随着年龄的增加下颌角的缩进更明显.结论 FGFR2 Ser252Trp点突变对小鼠下颌骨形状产生缩短畸形的影响,随着年龄的增加缩短影响有所加重.     

软骨细胞条件性敲除PTEN基因的FGFR3功能增强型点突变小鼠的获得及其表型初步分析

目的 获得在软骨细胞中条件性敲除PIEN基因的FGFR3增强型点突变小鼠并进行初步表型分析.方法 通过FTEN条件性基因敲除小鼠(Ptenflox/flox小鼠),与软骨细胞特异表达Cre重组酶的小鼠(Col2aCre)交配,获得在软骨细胞中特异敲除PTEN基因小鼠(Col2aCre:Ptenfolox/flox);同时,利用Ptenflox/flox小鼠与FGFR3增强型点突变小鼠(Fgfr3G369C/+小鼠,即ACH小鼠)交配,子代杂合子小鼠(Ptenflax/:ACH)之间再交配,获得Ptenflox/flox:ACH小鼠;通过Col2aCre:Ptenflox/flox和Ptenflox/flox:ACH交配即可获得在软骨细胞中特异性敲除PTEN基因的FGFB3增强型点突变小鼠((Col2aCre:Ptenflox/flox:ACH).采用PCR对小鼠基冈型进行鉴定,免疫荧光染色检测PTEN基因的敲除效率,通过X光平片摄影对小鼠的表型进行初步分析.结果 获得了在软骨细胞中敲除PTEN的FGFR3点突变小鼠,免疫荧光染色证实Col2aCre:Ptenflox/flox:ACH小鼠软骨细胞中PTEN蛋白因为基因敲除而表达很低.初步的表型分析显示:Col2aCre:Ptenflox/flox:ACH小鼠身长、尾长均较Pten flox/flox:ACH小鼠长(P＜0.05,n=5).Col2aCre:Ptenflox/flox:ACH小鼠表型,较Ptenflox/flox:ACH小鼠的侏儒表型有所缓解.结论 采用基于Cre/LoxP系统的条件性基因敲除策略,获得了在软骨细胞中敲除PTEN基因的FGFR3增强型突变小鼠,表型分析初步显示,软骨细胞特异性敲除PTEN基因可部分缓解由FGFR3增强型点突变所导致的小鼠侏儒表型.该小鼠的获得,为研究P13K/AKT信号通路在FGFR3突变介导的软骨生长抑制中的作用提供了实验动物平台.     

由80c196实现在LCD上的图文显示

介绍了以SED1330为显示控制器的LMG70520XNGR型液晶显示器（LCD）的性能，80c196单片机与LCD的软硬件接口技术以及在LCD上实现图文显示的显示方法。     

基于80C196KC的串行数据采集及控制系统的设计

本文介绍了以单片机80C196KC为核心构成串行数据采集及控制系统,该系统通过串行口与计算机通信,计算机可发指令给单片机实现系统控制,单片机实现数据采集,并将数据实时地传回计算机.系统利用单片机丰富的软硬件资源,可以实现采样、通讯、计算、脉冲计数等多种功能.实验表明,该方案是可行的,系统电路结构简单、功耗低,具有较高的性能价格比,特别适合基于计算机的便携式医学仪器的数据采集和系统控制.该系统已成功地应用于便携式多参数监护仪的开发.     

人用纯化Vero细胞狂犬病疫苗效果观察

目前 ,我国已研制成功精制地鼠肾细胞狂犬病疫苗 ,虽然效价已达到ＷＨＯ规定的 2 .5ＩＵ/剂 ,副反应亦有显著降低 ,但由于以原代地鼠肾细胞为基质 ,其制备需人工饲养并解剖大量地鼠 ,不适于工业化大生产 ,且很难控制细胞外源因子。Ｖｅｒｏ细胞是经ＷＨＯ检定合格并推荐作为生产人用灭活狂犬病疫苗的传代细胞 ,它不仅来源方便 ,繁殖速度快 ,维持时间长 ,容易控制外源因子污染 ,且对狂犬病毒敏感 ,适合大规模生产狂犬病疫苗。 1993年我们在卫生部批准立项 ,开始了Ｖｅｒｏ细胞狂犬病疫苗研制工作 ,并于 1998年研制成功。现将该疫苗人体观察结…     

HIF-1α条件性基因敲除嵌合体小鼠的获得

目的应用Cre/loxP系统建立HIF-1α条件性基因敲除小鼠模型。方法电击法将构建好的HIF-1α条件性基因敲除载体转染入小鼠ES细胞,用G418与Ganciclovir对转染的ES细胞进行正负筛选,经Southern杂交鉴定得到阳性ES细胞克隆后,将已发生正确重组的ES细胞显微注射入小鼠囊胚腔,对子代鼠进行基因型鉴定。结果经G418与Gan-ciclovir筛选培养得到490个阳性克隆,用5′端探针进行Southern杂交鉴定获得1株发生同源重组的ES细胞克隆,经显微注射,得到5只由基因敲除ES细胞和供体囊胚细胞共同发育而来的嵌合体小鼠。结论成功得到基于Cre/loxP系统的HIF-1α条件性基因敲除嵌合体小鼠模型。