原代培养小鼠关节软骨细胞的分化与诱导

背景：传统培养方法体外培养的软骨细胞经长时间传代培养后往往去分化为成纤维细胞,导致细胞数量及活性下降。如何避免培养过程中的去分化问题,是模拟体内软骨内成骨软骨发育过程的关键。 目的：课题创新性提出以Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶结合消化法体外培养扩增C57BL/6小鼠关节软骨细胞并诱导其向更成熟肥大软骨细胞或终末分化软骨细胞分化。 设计、时间及地点：细胞学体外观察实验,于2008-09/12在解放军第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军战创伤中心,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。 材料：C57BL/6品系新生小鼠9只。 方法：采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶结合消化法分离培养C57BL/6 新生小鼠关节软骨细胞,细胞计数法绘制细胞生长曲线,RT-PCR检测Ⅱ型胶原进行鉴定。当细胞90%融合时以含5.5 mg/L人转铁蛋白,3×10-8 mol/L亚硒酸钠,10 mg/L牛胰岛素的ITS诱导培养基进行分化诱导。 主要观察指标：诱导0,7 d,阿利新蓝染色检测软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖,von Kossa染色检测软骨细胞钙化结节形成情况,实时定量PCR检测Ⅱ型胶原、X 型胶原及基质金属蛋白酶13的表达进行鉴定。 结果：原代培养细胞24 h贴壁,呈三角或多角形,培养4~6 d进入快速增殖期,RT-PCR检测到Ⅱ型胶原的表达,证实获得大量高纯度、高活性的软骨细胞。诱导0 d,细胞单层铺满培养皿底面,无聚集现象;诱导7 d 明显可见由软骨细胞聚集形成的软骨小结。与诱导0 d时相比,诱导7 d阿利新蓝染色示软骨细胞分泌基质中的葡萄糖胺聚糖染色呈阳性,可见明显的软骨小结,Ⅱ型胶原及基质金属蛋白酶13表达明显增高,且钙化结节明显增多。 结论：采用胰蛋白酶和胶原酶结合消化法获得大量高纯度、高活性的软骨细胞。ITS诱导体系有效地促进了软骨细胞成熟及终末分化,较成功模拟了软骨内成骨的软骨发育过程。     

肝缺血预处理对NO、ET和LBF的影响

目的 探讨肝脏缺血预处理（IPC）后一氧化氮（NO）、内皮素（ET）和肝血流量（LBF）的变化,观察缺血预处理（IPC）对肝脏损伤的保护作用。方法 实验选用大鼠72只,分为缺血再灌注（I／R）组和IPC组。观察指标为NO、ET、LBF测定,时相为1小时、3小时、6小时和24小时。结果 NO测定在损伤与IPC两组间比较1小时、3小时有显著差异（P＜0．05）,经IPC后减少NO的释放。LBF测定在两组间比较,I／R组下降显著,IPC组除3小时外其它时相LBF显著增加,与I／R相比P＜0．05,各时相点均有显著差异（P＜0．05）。IPC组比I／R组ET释放减少,在 1小时、3小时有显著差异（P＜0．05）,两组与损伤前比较除IPC组3小时以外均有显著差异（P＜0．05）。结论 肝脏IPC可以减轻肝细胞的损伤,增加LBF,减少NO和ET的释放,调动机体的防御机制。     

利用CRISPR/Cas9基因编辑靶向下调FGFR2缓解Apert综合征小鼠颅缝早闭

Apert综合征 (Apert Syndrome, AS) 是一类常染色体显性遗传疾病,主要表现为颅缝早闭、中面部发育不良、 并指 (趾)、智力发育障碍等,多由FGFR2分子功能增强型点突变引起。目前,此疾病主要靠手术矫形来恢复功能,其中大脑等病变部位手术难度大,难以实施,且通常需要多次手术。CRISPR/Cas9基因编辑技术在人类遗传病治疗中具有巨大潜力。本研究筛选到靶向FGFR2基因的gRNA,与Cas9经慢病毒包装后作用于Apert小鼠 (FGFR2^+/P253R) 的原代颅骨细胞、体外培养的颅骨以及活体小鼠颅骨中,可敲低FGFR2的表达,改善Apert原代颅骨细胞的分化程度。CRISPR/Cas9处理体外培养的颅骨及注射至 Apert 小鼠头颅,颅骨冠状缝早闭状态有效缓解,异常降低的颅骨骨量、骨密度等也显著改善,表明 CRISPR/Cas9基因编辑可缓解 Apert小鼠头颅异常。本研究为 Apert综合征的基因治疗提供了实验依据,有望为其它骨骼遗传病治疗提供新的策略与借鉴。     

便携式多生命指征监护仪系统结构设计

本文介绍便携式多生命指征监护仪（ＰＬＳＭ）的结构设计。仪器可同时对心电、呼吸、无创血压、脉搏、血氧和体温６个参数进行实时监测，并具有便于携带、可连续长时间工作、操作简便以及工作环境适应能力和通信能力强的特点，具有很大的应用价值。     

以8098单片机为基础的阻抗式呼吸频率检测系统

以8098单片机为基础的阻抗式呼吸频率检测系统，采用液晶显示器作为显示屏，具有实时检测呼吸频率参数和自动报警功能，并可通过键盘设置呼吸频率上、下限值。     

fgfr3基因敲除载体的构建及中靶ES细胞的筛选与鉴定

目的构建成纤维细胞生长因子3型受体(nbroblast growth factor receptor-3,FGFR3)基因敲除载体,并对中靶ES细胞进行筛选与鉴定,为最终建立FGFR3条件性敲除小鼠模型或FGFR3功能减低小鼠,研究FGFR3在小鼠骨骼等器官发育、损伤修复过程中的作用打下基础。方法在分析小鼠fgfr3基因组DNA序列结构的基础上,设计并构建了针对小鼠fgfr3外显子9、10的条件性基因敲除载体,采用电穿孔法转染ES细胞,用G418与Gancyclovir对电转的ES细胞进行正负筛选,最后对ES细胞克隆做Southern与PCR鉴定。结果对ES细胞正负筛选后共挑取180个克隆;用5′端探针进行Southern杂交鉴定后发现2株阳性克隆;经PCR检测发现这两株克隆fgfr3的8号内含子内的LoxP序列丢失。结论得到两株fgfr3基因中只含有neo基因的ES细胞克隆,fgfr3的表达是降低的,可用来建立FGFR3功能降低的小鼠。     

基于单片机的便携式生命参数监护仪设计

采用单片机研制了一种便携式生命参数监护仪，用于多种环境下监测人体心率、脉搏血氧饱和度、呼吸频率、无创血压及体温等基本生命参数。系统采用2片80C196KC作为数据采集、处理及控制的核心单元，采用液晶显示器显示，非易失RAM保存数据，并提供了RS232接口与计算机进行数据交换。实验样机能正确地完成各项生命参数的监测，性能稳定。系统充分利用了单片机的优势，仪器体积小，功耗低。实验表明该设计方案是可行的。     

一种感觉神经定量测定仪的研制

开发一种以一片89C51单片机、一个精密正弦波发生器和一个高压恒流输出电路为核心，可产生3种不同频率(2000Hz、250Hz和5Hz)的正弦波精密恒定电流输出的感觉神经定量测定仪。其刺激输出强度范围为0．01mA--10．00mA。该仪器能比较客观地判断神经感觉状况，为临床神经病变的诊断提供一种新方法。