基因重组沙蚕纤溶活性蛋白的克隆、表达和活性检测

 目的从双齿围沙蚕消化道中克隆并表达具有纤维蛋白溶解活性的蛋白。方法提取沙蚕消化道上皮细胞RNA,逆转录获得cDNA。根据丝氨酸蛋白酶家族基因保守序列设计兼并引物,筛选包含丝氨酸蛋白家族保守位点的阳性克隆,进行核苷酸测序。根据该序列利用5′RACE技术进行扩增,将获得的基因片段克隆到pMAL-p2载体中,在大肠杆菌BL21中进行融合表达。表达的融合蛋白经过直链淀粉树脂亲和色谱和DEAE-Sepharose 4B纯化后,纤维蛋白平板法检测其溶栓活性。结果cDNA经5′RACE扩增获得长度为260 bp的基因片段,推测其包含可编码83个氨基酸的完整序列(约9.0×10³);重组pMAL-p2表达出51.0×10³的融合蛋白,经过测定具有明显的溶栓活性。结论从双齿围沙蚕中克隆获得的基因片段表达的融合蛋白具有溶栓活性,有望成为一种新型的纤溶药物。     

四肢经穴图稿

四肢经穴图稿姥芝瑞，李荣贵，陈太羲（香港亚太传统医药交流协会台中中国医药学院）主题词经穴／解剖学和组织学ＤｉａｇｒａｍｏｆＲｅｇｕｌａｒＡｃｕｐｏｉｎｔｓｏｎＬｉｍｂｓ￥ＭｏＺｈｉｒｕｉ；ＬＩＲｏｎｇｇｕｉ；ＣｈｅｎＴａｉｘｉＡｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉ...     

Smad7稳定转染胶质母细胞瘤细胞系的建立

目的建立Smad7稳定转染胶质母细胞瘤细胞株,并观测Smad7表达对U251细胞增殖的影响。方法应用脂质体将真核细胞表达质粒pCDNA3.0-Smad7和空载质粒pCDNA3.0转染人胶质母细胞瘤细胞。并在转染后绘制生长曲线以观测细胞增殖。结果RT-PCR和westem blot证实Smad7在转录和蛋白翻译水平上均呈高表达。Smad7转染后,细胞增殖速度减慢。结论Smad7稳定转染胶质母细胞瘤细胞株已成功建立,Smad7高表达可抑制胶质母细胞瘤细胞株的增殖。     

下调HMGA2基因表达对改善骨肉瘤U2OS细胞恶性表型的实验研究

目的:研究HMGA2表达在维持人骨肉瘤U2OS细胞恶性表型中的作用,为基因靶向治疗提供理论依据。方法:采用基于DNA的shRNA表达载体HMGA2-shRNA,稳定转染人骨肉瘤U2OS细胞,下调其HMGA2表达水平,并应用RT-PCR技术检测其对HMGA2基因的沉默效果;经Cell Counting Kit-8(CCK8)测定、Hoechst33342染色荧光显微镜观察及Boyden小室法分别检测细胞增殖、凋亡及迁移情况;实时定量RT-PCR检测mRNAs表达水平。结果:稳定转染靶向HMGA2的shRNA可特异性下调U2OS细胞HMGA2 mRNA表达水平;其作用结果使细胞的增殖和迁移能力受到明显抑制,自发凋亡率及Caspase 3和Caspas 9基因表达水平显著升高。结论:HMGA2基因异常表达在维持人骨肉瘤U2OS细胞恶性表型中起重要作用,靶向HM-GA2的基因治疗可能为骨肉瘤治疗带来新希望。     

基因重组沙蚕纤溶活性蛋白的克隆、表达和活性检测

目的 从双齿围沙蚕消化道中克隆并表达具有纤维蛋白溶解活性的蛋白.方法 提取沙蚕消化道上皮细胞RNA,逆转录获得cDNA.根据丝氨酸蛋白酶家族基因保守序列设计兼并引物,筛选包含丝氨酸蛋白家族保守位点的阳性克隆,进行核苷酸测序.根据该序列利用5‘RACE技术进行扩增,将获得的基因片段克隆到pMAL-p2载体中,在大肠杆菌BL21中进行融合表达.表达的融合蛋白经过直链淀粉树脂亲和色谱和DEAE-Sepharose 4B纯化后,纤维蛋白平板法检测其溶栓活性.结果 cDNA经5‘RACE扩增获得长度为260 bp的基因片段,推测其包含可编码83个氨基酸的完整序列(约9.0×103);重组pMAL-p2表达出51.0×103的融合蛋白,经过测定具有明显的溶栓活性.结论 从双齿围沙蚕中克隆获得的基因片段表达的融合蛋白具有溶栓活性,有望成为一种新型的纤溶药物.     

Smad蛋白在乳腺癌和正常乳腺上皮细胞中的表达及意义

目的：检测TGFβ₁、TGFβ受体Ⅱ及其下游Smad调节因子等基因在乳腺癌和正常乳腺上皮细胞中的表达,探讨TGFβ在乳腺癌发展过程中发挥作用的分子机制。方法：分离纯化人正常乳腺上皮细胞,应用RT-PCR检测乳腺癌细胞系MCF7及正常乳腺上皮细胞中TGFβ₁、TGFβ受体Ⅱ、Smad4、Smad6、Smad7的表达。结果：TGFβ₁、TGFβ受体Ⅱ、Smad6、Smad7与内参照GAPDH比值在正常乳腺上皮细胞中（0.721±0.214、1.001±0.312、0.689±0.12和0.221±0.124）与MCF7细胞（0.698±0.324、0.998±0.217、0.718±0.257;0.246±0.138）比较表达水平差异无显著性,Smad4在乳腺癌细胞中的表达水平（0.498±0.221）低于正常乳腺上皮细胞（1.132±0.314）（P<0.05）。结论：Smad4在乳腺癌细胞中的低表达可能与TGFβ对乳腺癌的促癌作用有关联。     

转移潜能不同的人前列腺癌细胞系差异膜蛋白质组学的分析

目的:通过应用鸟枪法蛋白质组学技术发现早期诊断和逆转前列腺癌转移的分子标志.方法:应用鸟枪法蛋白质组学技术,比较人高转移前列腺癌细胞株(PC-3M) 和人低转移前列腺癌细胞株(PC-3) 间膜蛋白表达的差异.用SDS-PAGE 胶分离膜蛋白, 并且进行胰酶消化,用反相液相色谱分离肽混合物后进行ESI-MS/MS鉴定,用数据库查询结合生物信息学技术比较分析并识别细胞间的差异表达膜蛋白.结果:1)利用Gel-1DLC-MS/MS 分析,在严格的过滤参数条件下鉴定了PC-3和PC-3M两种细胞中的蛋白,在PC-3细胞中鉴定了2 172个蛋白,在PC-3M细胞中鉴定了2 023个蛋白.2)用GOA分析软件进行分类,PC-3细胞中1 499个蛋白为已知细胞组分,其中564 (38.13%) 个蛋白为膜蛋白或者膜相关蛋白;PC-3M 细胞中1 391个蛋白为已知细胞组分,细胞组分中527(38.30%)个为膜蛋白或者膜相关蛋白.几个假设蛋白和cDNA序列也被预测.3)用蛋白名称和IPI数据库号对比分析后发现有161个蛋白质仅在PC-3前列腺癌细胞株中检测到有表达,135个蛋白质仅在PC-3M中检测到有表达.结论:人高、低转移前列腺癌细胞株的膜蛋白表达存在明显差异,为进一步发现前列腺癌转移相关分子和阐明前列腺癌侵袭转移的分子机制提供实验证据.     

MicroRNA-29b的研究现状

<正>1 miRNA简介miRNA广泛存在于自然界中,是一种大小约为22 nt的内源性非编码的单链微小RNA[1],它的成熟过程需要经历以下几个步骤[2]:首先以内源性转录本为模板进行基因转录,形成发夹状的原始pri-miRNA,接着于细胞核内经过Drosha切割,被加工成具有茎环结构的70 nt左右的前体pre-miRNA,     

高迁移率蛋白A2基因真核表达载体构建与表达鉴定

目的：构建高迁移率蛋白A2（HMGA2）基因的真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达,为进一步研究HMGA2 基因功能奠定理论基础。方法：采用RT-PCR 方法从人乳腺上皮HBL-100 细胞中扩增HMGA2 基因全长cDNA,扩增产物经双酶切及凝胶回收后,直接克隆至黄绿色荧光真核表达载体YFP-C1中,构建YFP- C1-HMGA2重组质粒。将YFP-C1-HMGA2真核表达载体转染到人前列腺癌PC3细胞中,通过RT-PCR方法验证所构建的真核表达质粒YFP-C1-HMGA2的正确性。结果：RT-PCR获得长度为351　bp的HMGA2全长cDNA,经YFP-C1真核表达载体克隆、酶切鉴定及测序分析,测序结果示基因序列与GenBank序列一致,证实真核表达质粒YFP-C1-HMGA2构建成功,并且能够在真核细胞中表达。结论：成功克隆了HMGA2基因,构建了YFP-C1-HMGA2重组质粒。     

亚砷酸钠对人脐静脉内皮细胞迁移、增殖的影响及其机制

目的 探讨亚砷酸钠对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)迁移和增殖的影响.方法 通过细胞损伤修复实验和细胞增殖实验分别观察亚砷酸钠对细胞迁移、增殖能力的影响.RT-PCR分析其mRNA表达.结果 亚砷酸钠抑制HUVECs迁移和增殖能力,两者均呈典型的剂量效应关系.并发现亚砷酸钠下调HUVECs的黏着斑激酶(FAK)和原癌基因蛋白(c-Myc)的mRNA水平.结论 亚砷酸钠通过下调FAK和c-Myc基因表达抑制细胞迁移和增殖能力,提示其在损伤血管内皮细胞修复机能中起重要作用.