人CD40—Ig融合蛋白表达载体的构建及其在COS—7细胞的表达

ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ途径是除Ｂ７／ＣＤ２８途径之外的重要的共刺激信号转导途径,在Ｔ细胞活化过程中扮演着十分关键的角色。因而,该途径可能在同种移植排斥的诱导和效应阶段的不同时期发挥关键作用。本研究旨在获得人ＣＤ４０分子胞外区和人ＩｇＧ１Ｆｃ段的融合蛋白,以探索阻断ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ共刺激途径在免疫治疗中的潜在应用。首先,从人Ｂ淋巴瘤细胞系Ｄａｕｄｉ中提取细胞胞总ＲＮＡ,利用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增人Ｃ     

兔骨髓间充质干细胞的培养及生物学特性

目的建立体外分离、培养扩增兔骨髓间充质干细胞的最佳条件，观察其生物学活性及诱导分化，初步探索MSC在生物材料支架内的增殖情况。方法采用Percoll(比重1．073)或Ficoll(比重1．007g／ml)分离骨髓单个核细胞，以含10％的胎牛血清DMEM／F12作为培养体系，用体外贴壁培养的方法筛选MSC。用流式细胞仪测定其细胞周期，以MTT比色法测定细胞增殖活性并计算其倍增时间，检测MSC的细胞化学特征，体外观察MSC在特定的诱导体系下向成骨和脂肪细胞分化，并用电镜观察了MSC在生物材料支架内的生长情况。结果用此方法分离培养的MSC经9天左右的淘汰培养即可得到第一代的细胞。细胞化学染色碱性磷酸酶、苏丹黑B、过氧化物酶阴性，非特异性酯酶、糖原呈阳性。培养扩增的细胞形态呈梭状，具有较快的增殖能力，细胞倍增时间在19．4h。2～8代的细胞呈均质状，且具有较好的多向分化的能力。结论分离培养的兔骨髓间充质干细胞在体外具有多向细胞分化的能力，具有人骨髓间充质干细胞生物学特性。     

原代白血病细胞体外分化诱导研究——维生素A酸和三尖杉酯碱的诱导分化作用

体外实验已证实维生素A酸(RA)可以诱导HL-60,u_(937)等白血病细胞系分化成熟,三尖杉酯碱(Harr)也能在体外诱导HL-60细胞系向粒或单核细胞分化。目前,有关RA和Harr对原代白血病细胞诱导分化作用的研究尚不多。本文观察RA和Harr对急非淋白血病(ANLL)和慢粒白血病(CML)患者白血病细胞的诱导分化作用,为这两种药物的临床应用提供更多的实验依据。     

人CD40-Ig融合蛋白在CHO细胞中的表达与纯化研究

目的 建立稳定表达CD40－Ig融合蛋白的工程细胞株,获得大量融合蛋白以研究靶向阻断CD40：CD40L途径防治移植物抗宿主病（GVHD）策略的应用潜力。方法 自真核瞬时表达载体pIG／40Ig中切下CD40－Fc融合基因,插入pcDNA3．1载体中构建稳定表达载体。利用脂质体Lipo-fectamine将该载体转染CHO细胞,G418筛选抗性克隆;夹心ELISA法检测上清中CD40－Ig融合蛋白的表达;Westem blot法鉴定其免疫学活性。利用有限稀释法对筛选出的混合克隆单克隆化。滚瓶法无血清大批培养工程细胞,ProteinA亲和层析法纯化,SDS－PAGE后薄层扫描分析纯度。利用流式细胞术检测该蛋白与Jurkat细胞表面CD40L的结合功能。结果 CD40－Fc融合基因插入pcDNA3．1载体后构建成功稳定表达载体p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为p3．1／40Ig,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达CD40－Ig融合蛋白的基因工程细胞株,命名为B2。ProteinA亲和层析纯化融合蛋白纯度达95％以上,该融合蛋白可特异结合Jukat细胞表面的CD40L。结论 CD40－Ig融合蛋白可模仿天然分子与其配基结合,为研究靶向CD40：CD40L途径的治疗制剂在防治GVHD中的潜在应用提供了有用的工具。     

曲古抑菌素A对前列腺癌LNCaP细胞抑制效应的细胞信号通路研究

目的：研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A（1SA）对前列腺癌LNCaP细胞抑制作用的细胞信号机制。方法：半固体培养检测TSA对前列腺癌细胞集落形成能力的影响；Westem Blot分析细胞蛋白乙酰化水平、细胞信号通路蛋白及细胞周期相关蛋白的表达。结果：TSA能够有效杀伤前列腺癌LNCaP细胞，在较低浓度即能抑制具有集落形成能力的细胞；药物处理使细胞内蛋白乙酰化水平增高，乙酰化组蛋白H3积累，多种细胞信号通路的相关蛋白如雄激素受体、HER2、Raf-1、Akt、CDK4等呈时间依赖性和剂量依赖性被清除。结论：TSA能够同时阻断对细胞生长具有重要作用的多条细胞信号通路，从而对前列腺癌LNCaP细胞发挥抑制作用。     

胎儿心脏黏附细胞具有类似间充质祖细胞特征

为了观察人心脏是否含具有间充质祖细胞特性的细胞，从胎儿心脏分离、培养单个核细胞并从形态、表型和功能3个方面与骨髓间充质祖细胞进行比较和鉴定。结果表明，从心脏分离培养的细胞为成纤维样，表面抗原为CD73，CD105，CD29，CD44，HLA-ABC，CD166阳性，而CD45，CD34，CD86，HLA-DR阴性。在不同的分化体系中，细胞能分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。细胞扩增迅速，具有低免疫原性特性。结论：从心脏分离培养的细胞具有间充质祖细胞特性。     

Biological features of mesenchymal stem cells from human bone marrow

Objective To study the biological characteristics of mesenchymal stem cells (MSCs) from human bone marrow. Methods A culture of mesenchymal stem cells was initiated from bone marrow low-density mononuclear cells separated by Percoll Centrifugation and maintained in low-glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) with 10% selected fetal calf serum. Cell growth pattern and its responses to cytokines were evaluated by trypan blue exclusion and MTT test, respectively. Cell cycle and surface antigenic features were analyzed by flow cytometry technique. Cytochemistry characteristics of MSCs were determined.Results Easy-handling methods to isolate and culture expand MSCs were developed in this study. MSCs were unique in their phenotypes. They were positive for CD29, CD44, CD166, and negative for CD34, CD45, HLA-DR and Ulex europaeus. Cytochemistry evaluation showed that MSCs were homogeneously positive for acid α-naphthl acetate esterase (ANAE), glycogen (periodic acid Schiff reaction, PAS), and negative for acid phosphatase (ACP) and the Sudan black reaction (SB). Around 5% of them were positive for alkaline phosphatase (ALP). The cells had a population doubling time of 30 hours and cell cycle analysis showed that approximately 10% of them were in S phase. MSCs grew at significantly different rates when incubated in the presence of various recombinant human cytokines, of which interferon γ, tumor necrosis factor α, stem cell factor and insulin-like growth factor promoted the proliferation of MSCs dramatically, while others tested had no effects on cell growth. Conclusions MSCs are a homogenous population of cells that have unique growth, phenotypical and cytochemical characteristics. Furthermore, the diverse responses of MSCs to different cytokines provide a clue for the selection of optimal expansion and maintenance of MSCs.     

人骨髓间充质干细胞支持体外造血

体内的稳态造血依赖于复杂而完整的骨髓造血微环境系统,其中的细胞成分是该系统的关键。存在于骨髓中的间充质干细胞（ＭＳＣｓ）是成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞等多种骨髓基质细胞的前体细胞,在造血调控中可能具有一定的作用。本研究首先建立了成人骨髓ＭＳＣｓ的分离及体外培养的方法,并应用长期骨髓细胞培养体系,观察了ＭＳＣｓ滋养层体外维持长期培养启动细胞（ＬＴＣ－ＩＣ）的能力及其促进造血细胞分化的功能     

TC-1基质细胞系促进逆转录病毒介导的小鼠骨髓造血细胞基因转移的实验研究

目的:摸索逆转录病毒介导的理想的造血细胞基因转染体系.方法:以人多药耐药基因1(mdr-1)及增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)为报告基因,比较了小鼠骨髓细胞与病毒包装细胞共培养、与骨髓基质细胞系TC-l共培养及单纯上清感染等不同体系的转染效率.结果:与单纯上清转染法相比,TC-1基质细胞可明显提高外源基因的转染效率.3组中,以与病毒包装细胞共培养组转染效率最高.结论:骨髓基质细胞介导基因转染的方法,既可促进靶基因的转染效率,又可避免重组辅助病毒引起的感染,具有较好的临床应用前景.     

细胞毒药物对小鼠肺组织和骨组织间充质干细胞增殖和分化的影响

背景：肿瘤患者接受高剂量化疗时，细胞毒药物不仅对肿瘤细胞产生杀伤作用，对正常组织细胞甚至组织干细胞也产生一定损伤。 目的：探讨细胞毒药物体外对小鼠肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞增殖及分化能力的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察，于2007-05/2008-08在解放军军事医学科学院基础医学研究所细胞生物学室和解放军北京军区总医院肿瘤科完成。 材料：清洁级3~5周龄C57BL/6小鼠3只，由解放军军事医学科学院实验动物中心提供。 方法：从胶原酶消化的小鼠肺组织和骨片中分离培养肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞，并在含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液中培养、传代、扩增。采用MTT法测定马利兰、阿霉素、环磷酰胺、足叶乙甙、甲氨蝶呤、长春新碱、顺铂对两种间充质干细胞生长增殖的影响，参照文献设置药物浓度范围，并设立空白对照，仅加入含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养液。药物作用后，分别诱导两种间充质干细胞向脂肪和成骨细胞分化。 主要观察指标：不同药物作用后，肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞的生长抑制、增殖情况及分化能力。 结果：①在治疗剂量范围内，肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞对环磷酰胺、马利兰和甲氨蝶呤耐受，而对长春新碱、足叶乙甙、顺铂、阿霉素中度敏感。肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞对环磷酰胺、马利兰的敏感性相似，但小鼠肺组织间充质干细胞对甲氨蝶呤、长春新碱、足叶乙甙、阿霉素的敏感性均低于骨组织间充质干细胞，对顺铂的敏感性高于骨组织间充质干细胞。②与空白对照比较，环磷酰胺、马利兰和甲氨蝶呤作用后对两种间充质干细胞的增殖能力影响较小。③在环磷酰胺、马利兰、甲氨蝶呤、长春新碱和足叶乙甙等药物作用24 h内，两种间充质干细胞仍能被诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。药物作用72 h后，两种间充质干细胞向脂肪和成骨细胞的分化能力减弱甚至消失。环磷酰胺、马利兰和甲氨蝶呤对肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞的分化功能影响相对较小。 结论：细胞毒药物对小鼠肺组织间充质干细胞和骨组织间充质干细胞具有毒性作用，但不同组织器官来源的间充质干细胞对细胞毒药物的敏感性存在一定差异；药物作用后可影响两种间充质干细胞的增殖和分化能力。