人胚胎脐血间质干细胞生物学特性研究

摘要目的:研究人中期胚胎脐血间质干细胞生物学特性,探讨其在自体宫内基因转移/治疗(IUGT)领域的应用前景。方法:采用L-DMEM完全培养液培养中期胚胎脐血间质干细胞(MSC);流式细胞仪技术检测细胞表面标记;地塞米松/胰岛素等作为脂肪细胞诱导液,β-甘油磷酸钠/抗坏血酸等作为成骨细胞诱导液分别诱导细胞分化;将携带有绿色荧光蛋白的重组腺病毒转染MSC,荧光显微镜下检测MSC表达转基因特性;F344新生大鼠肝内注射MSC,免疫荧光检测6周后不同组织器官中人MSC存在;非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷性小鼠(NOD/SCID)皮下注射MSC,病理切片检测第30d细胞体内成瘤性。结果:3mL人中期胚胎脐血可以分离、培养出MSC,细胞均一地表达CD29、CD44、CD59、CD105、CD166,不表达CD34、CD45、CD80、CD86、CD42a、HLA-DR分子,体外培养中具有成脂、成骨能力;细胞表达转基因产物绿色荧光蛋白阳性率高达56.32%±3.28%;在新生大鼠体内,人中期胚胎脐血来源的MSC能向多个不同组织器官迁移,在NOD/SCID小鼠内不具有成瘤性。结论:人中期胚胎脐血MSC适合中、晚期胚胎自体IUGT靶细胞。      

体外诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞的初步研究

目的 初步研究诱导胚胎干细胞ES－D3细胞系向神经细胞定向分化可能性,为青光眼等视网膜视神经疾病的治疗提供可能的途径。方法 以Buffalo大鼠肝细胞培养上清进行胚胎干细胞ES－D3细胞系培养,参照Bain等方法进行改良,以视黄酸对ES－D3细胞进行分化诱导,1d后加入阿糖胞苷,相差显微镜下观察细胞生长情况。结果 加入视黄酸后1d,相差显微镜下可见散在1个、2个或多个突起的神经样细胞。加入视黄酸后2d、阿糖胞苷后第1d,可见大量1条、2条或多条突起的神经样细胞,并相连成网络结构。结论 视黄酸辅以阿糖胞苷在体外可成功诱导胚胎干细胞ES－D3细胞系成为神经样细胞,并形成网络,结合我们裸鼠眼内接种ES－D3细胞分化为神经细胞样细胞研究结果,胚胎干细胞定向分化及移植,可望成为青光眼等视网膜视神经疾病治疗的一个新的途径。     

术前输注供者CD80~(low)/CD86~(low)树突状细胞,延长小鼠同种异体移植心脏存活

目的 :应用B7- 1和B7- 2反义寡核苷酸 (ASB7- 1/ASB7- 2oligo)抑制CD80 (B7- 1)、CD86 (B7- 2 )在供体小鼠骨髓树突状细胞 (DC)上的表达 ,观察这类DC对同种异体小鼠心脏移植存活时间的影响并探讨其机理。方法 :小鼠B7- 1和B7- 2反义寡核苷酸在lipofectamine协助下分别转染供体鼠C5 7BL/10J(B10 )小鼠骨髓DC ,流式细胞仪检测其CD80 /CD86的表达 ,证实为CD80 low/CD86 low。将各组DC经尾静脉输注到受体小鼠C3H/HeJ(C3H)体内 ,1周后进行心脏移植术 ,观察存活时间 ;体外实验观察各组DC对同种异体T细胞的激活作用 ,包括混合淋巴细胞反应、细胞毒性效应、及IL - 2的产生。结果 :ASB7- 1和ASB7- 2分别显著抑制DC表达CD80 /CD86 ;转输这些CD80 low/CD86 lowDC可使小鼠心脏移植物存活时间显著延长 ,分别为 (18.6± 0 .89)d和 (2 3.6 7± 10 .73)d ,与转输成熟骨髓DC(IL - 4DC)组和生理盐水注射组(6 .2 2± 0 .97)d、(11.17± 1.72 )d比较 ,均有显著差异 (P <0 0 1) ;CD80 low或CD86 lowDC对异体T细胞激活作用较弱 ,表现为T细胞增殖能力、IL - 2产生及细胞毒杀伤均明显低。结论 :应用反义寡聚核苷酸转染供者DC ,降低其CD80或CD86的表达 ,可以抑制供者特异性的免疫应答 ,延长移植物存活时间。     

MHCⅠ类基因转移诱导移植免疫耐受的研究

本研究用体内外实验观察MHC Ⅰ类基因转移对移植物免疫原性的影响。并用小鼠心肌移植模型, 探讨通过MHCⅠ类基因转移延长移植物存活的可行性。结果表明, 正常对照组小鼠的心肌移植物平均存活时间(MST) 为9-4d±1-84d。诱导耐受组小鼠的心肌移植物MST为45-7d±6-0d, 比对照组明显延长( P<0-05) 。提示将供体MHC Ⅰ类基因转移到受体造血细胞, 可以降低移植物的免疫原性, 延长移植物的存活时间     

人脐血单核细胞诱导分化为神经样细胞的实验研究

目的探讨人脐血单核细胞向神经细胞分化的潜能,为其治疗神经系统疾病提供实验依据。方法采用HES法分离脐血单核细胞（UCBMNCs）,L-DMEM培养液原代和传代培养UCBMNCs,碱性成纤维细胞生长因子诱导细胞向神经细胞分化,应用流式细胞仪和免疫组化方法分析细胞中nestin、NSE阳性表达情况。结果原代UCBMNCs中有少量细胞表达nestin,阳性率为3.85%±0.88%;经诱导分化后原代（P0）和第10代（P10）细胞形态向神经样细胞转变：NSE阳性表达率分别为25.8%±4.6%、89.3%±8.5%;nestin阳性表达率分别为27.8%±5.8%和86.7%±6.8%。结论UCBMNCs具备神经样细胞分化潜能。     

同种移植大鼠心脏Ⅱ类主要组织相容性抗原表达及其机制探讨

目的　探讨同种移植心脏术后Ⅱ类主要组织相容性 (MHC)抗原表达及其影响机制。方法　建立大鼠颈部心脏移植模型 ,以同基因移植和无移植动物作为对照 ,采用免疫组化、逆转录PCR等技术测定异基因大鼠移植心脏Ⅱ类MHC抗原表达和心肌IL 2、IL 4mRNA的水平变化。结果移植心脏Ⅱ类MHC抗原表达与心肌急性免疫排斥病理学改变明显相关 (P <0 0 1 ) ,排斥早期其阳性表达细胞位于小血管内皮及周围 ,随着急性免疫排斥病变发展心肌IL 2、IL 4mRNA水平与Ⅱ类MHC抗原表达存在相关变化 (P <0 0 1 )。结论　移植心脏Ⅱ类MHC抗原表达是术后急性免疫排斥识别和效应时相的重要环节 ,急性免疫排斥早期移植心脏功能改变可能与微血管内皮损伤有关 ,受体细胞因子网络对供体Ⅱ类MHC抗原表达有调节作用     

骨髓间质干细胞在造血干细胞移植中的作用

骨髓间质干细胞(MSC)被认为是骨髓基质细胞(脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞)的共同前体细胞。在体外易于传代扩增,且具有多向分化潜能。已有实验表明MSC在体外可通过分泌许多细胞因子或表达与造血干细胞黏附、归巢有关的黏附分子以及细胞外基质蛋白发挥造血支持作用。最近的资料进一步揭示了MSC在造血干细胞移植中的多方面作用。它一方面促进造血干细胞植入并促使其沿多系方向分化;另一方面可发挥免疫调节作用,降低移植物抗宿主病发生率及严重程度,且MSC的这些作用均不受主要组织复合体的限制。尽管MSC对造血干细胞移植具有明显作用,但其在同种异体的长期存在与分布依然需要进一步阐明。     

骨髓间质干细胞抑制大鼠肝纤维化形成的可能性：受体肝内干细胞存活时间、肝星状细胞活化程度及生存分析的7周观察

目的：观察在体外培养条件下，具有强大的增殖和分化为肝细胞能力的骨髓间质干细胞输注治疗肝纤维化模型大鼠对其肝纤维化形成的影响及肝功能和生存分析，并对治疗组、空白对照组和病理对照组7周内的相关情况予以对照比较。方法：实验于2003-08／2004-10在中山大学基础医学院病理学于病理生理实验室完成。①动物分组：选用雄性6周龄Wistar大鼠5只为供体，供分离骨髓间质干细胞；雌性6周龄Wistar大鼠60只，其中50只被造成肝纤维化模型，在首次用二甲基亚硝胺处理后的第10天，将造模大鼠随机分为2组：骨髓间质干细胞治疗组10只(为受体)，于治疗39d后结束实验，取材分析病理对照组40只。另10只作为空白对照组(仅静脉注射生理盐水)。②肝纤维化模型制作：在实验的当天，给予10g／L二甲基亚硝胺溶液(生理盐水配置)1mL／kg，腹腔注射，每周连续3次，共6周。③骨髓间质干细胞治疗组：每只大鼠输注3&;#215;106个骨髓间质干细胞；病理对照组：使用等体积生理盐水代替骨髓间质干细胞。④动物的一般生活状态：每天观察饮食、活动、二便、体质量、皮毛、呼吸情况等。⑤肝脏的组织细胞形态结构：将肝组织以苏木精-伊红染色后观察。⑥肝星形细胞及其活化程度检测：前者检测肝脏α-平滑肌肌动蛋白含量，用免疫组织化学染色法，后者以德国IBAS2．5图像分析软件半定量分析。⑦肝脏胶原分布的相对含量检测：采用Masson三色染色法，从而反映肝纤维化程度。⑧肝脏羟脯氨酸含量测定：采用氯胺T法。⑨血清总胆红素和谷丙转氨酶水平检测：采用全自动生化分析仪。⑩血清层粘蛋白和透明质酸水平测定：采用放射免疫法。（11）雄性大鼠骨髓间质干细胞在雌性大鼠肝内的Y染色体性别决定区基因的表达检测：采用聚合酶链式反应。（12）统计学分析：两组样本均数比较采用t检验；多组样本均数比较采用方差分析，两两比较采用q检验；生存分析采用Kaplan-Meier法。结果：雌性大鼠60只进入结果分析。①实验动物生存状况：造模6周后，骨髓间质于细胞治疗组生存率为80％，而病理对照组生存率为10％，空白对照组生存率为100％，说明骨髓间质干细胞治疗可能通过阻止肝纤维化发展，从改而善大鼠的生存率。②肝脏组织学显示，骨髓间质干细胞治疗组的肝脏结构明显改善，炎症减轻、假小叶结构减少或消散。相反，病理对照组出现广泛的肝脏结构重塑，包括增厚的纤维间隔形成和明显的桥接坏死。半定量分析胶原染色，骨髓间质干细胞治疗组较病理对照组显著减低(8．12&;#177;1．98．15．71&;#177;2．13，t=6．11，P&;lt;0．05)。③肝脏星状细胞活化的标志α-平滑肌激动蛋白的阳性表达：空白对照组仅见血管壁有少量α-平滑肌激动蛋白的阳性表达，而病理对照组和骨髓间质干细胞治疗组可见在纤维间隔、肝窦和汇管区内明显表达。半定量分析α-平滑肌激动蛋白的阳性染色，骨髓间质干细胞治疗组较病理对照组显著减低(11．06&;#177;2．03，18．50&;#177;3．87，t=4．47，P&;lt;0．05)。④Y染色体性别决定区基因的表达：经雄性Wistar大鼠(供体)骨髓间质干细胞治疗39d的雌性大鼠，肝脏DNA经聚合酶链式反应检测结果显示，Y染色体性别决定区基因的表达阳性，而空白对照组和病理对照组则无此阳性信号。说明骨髓间质干细胞移植后，能够在受体肝内存活5周以上。⑤反映肝脏纤维化程度的肝脏羟脯氨酸含量及血清层黏蛋白和透明质酸水平：骨髓间质干细胞治疗组明显高于空白对照组(P&;lt;0．05)但明显低于病理对照组(P&;lt;0．05)，说明骨髓间质干细胞治疗后能够减少肝脏胶原蛋白的含量，从而减少肝纤维化的形成，使肝纤维化得到控制。⑥反映肝功能的血清总胆红素、谷丙转氨酶水平：骨髓间质干细胞治疗组明显低于病理对照组(P&;lt;0．05)，接近空白对照组。说明了骨髓间质干细胞治疗有助于改善肝功能状态。结论：①二甲基亚硝胺能成功诱导大鼠肝纤维化模型的建立。②骨髓间质干细胞可改善肝纤维化大鼠的生存状况和肝功能。③骨髓间质干细胞能够减少肝脏胶原蛋白的产生，抑制肝纤维化形成。④肝纤维化发生发展过程中活化态的肝星状细胞数量减少可能是骨髓间质干细胞抑制肝纤维化形成的原因之一。⑤雌性大鼠肝脏内存在雄性供体Y染色体性别决定区基因的信号说明骨髓间质干细胞能够在受体肝内存活5周以上。     

隐丹参酮诱导猴骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞

目的：体外培养猴骨髓间质干细胞（MSCs）并定向诱导分化为神经元样细胞。方法：体外分离培养猴MSCs,流式细胞仪检测其表面标志,用含隐丹参酮的无血清L-DMEM诱导MSCs分化为神经元样细胞,免疫细胞化学检测单克隆抗体特异性神经元烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果：体外培养的猴MSCs表达CD29、CD44、CD105、CD166,并且具有正常的二倍体核型,不随传代而发生改变。bFGF预诱导24h后,隐丹参酮可以将MSCs诱导为神经元样细胞,免疫细胞化学显示NSE、NF表达阳性,阳性率分别为68.3％±3.5％、70.3％±1.5％,而GFAP表达阴性。结论：隐丹参酮可以在体外将猴MSCs诱导分化为神经元样细胞。     

大鼠骨髓间质干细胞基本生物学特性的研究

摘要目的:研究成年大鼠骨髓间质干细胞(rBMMSCs)的基本生物学特性,并与成人骨髓间质干细胞(hBMMSCs)作比较。方法:分别采用贴壁法和Ficoll-Paque淋巴细胞分离法分离获得rBMMSCs和hBMMSCs,进行体外传代、扩增、纯化,比较分析不同代数的rBMMSCs和hBMMSCs的增殖能力和克隆形成能力,观察传代次数对rBMMSCs的神经分化能力的影响,流式细胞仪检测rBMMSCs表面抗原表达;采用中期分裂相秋水仙素阻抑法分析rBMMSCs的核型。结果:原代rBMMSCs和hBMMSCs在体外扩增后可分别获得(7-8)×10⁵和(5-6)×10⁵个细胞,体外扩增5代后可分别获得1.7×10⁸和l×10⁸个细胞,体外扩增15代后,可分别获得(4-8)×10¹²和(3-4)×10¹²个细胞,随着传代次数的增加,细胞的增殖能力、克隆形成能力和神经分化能力有所下降,但各代rBMMSCs的增殖能力和克隆形成能力都比hBMMCs较强。流式细胞仪检测结果显示rBMMSCs的CDllb、CD45、CD61、CD71、CD8O、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ表达为阴性,而CD29和CD44表达阳性。rBMMSCs为正常大鼠二倍体核型。结论:rBMMSCs具有极强的自我更新能力和神经分化能力,是一种具有正常二倍体核型的间质干细胞,在组织工程中具有广阔的应用前景。