产单核李斯特菌的改良分子信标荧光PCR-磁捕获快速检测体系的建立

[目的]建立改良分子信标荧光PCR-磁捕获快速检测产单核李斯特菌(LMO)的体系,应用于食品中LMO的污染状况调查及食物中毒快速诊断. [方法]根据GenBank公布的LMO hlyA基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标荧光PCR检测体系.运用磁捕获材料对PCR检测阳性的增菌液进一步处理后划平皿做分离培养. [结果]改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为110 fg,菌液灵敏度为99 cfu/ml或4 cfu/PCR反应体系,无交叉反应.以此反应体系检测28株LMO,均出现特异的荧光信号.对228份食品进行LMO检测,8份增菌液LMO实时荧光PCR阳性.用磁捕获材料处理此8份增菌液,全部细菌培养阳性,高于国标法的6份阳性.[结论]改良分子信标一实时PCR反应体系快速、灵敏度高,特异性强,运用磁捕获试剂能有效提高培养阳性率.应用该检测系统能提高LMO的检出率和准确性.该系统可应用于LMO食品污染状况调查及食物中毒的快速诊断.     

ARMS实时PCR和MALDI-TOF-MS进行K-ras基因分型

[目的]建立K-ras基因12位密码子第一、二位点基因分型的研究模型.[方法]采用ARMS实时PCR和MALDI-TOF-MS两种方法,以自行构建的质粒DNA为模板,建立K-ras基因12位密码子第一、二位点基因分型的研究模型.[结果]在相同的扩增条件下,采用ARMS实时PCR方法,第一个位点的野生型和突变型的△Ct值至少为8,但第二个位点野生型和突变型的△Ct值仅为1～2左右.第二个位点改用MALDI-TOF-MS分型方法,采用一条公用引物和dATP,ddTTP,ddCTP和ddGTP的混和物,12密码子第二位点基因分型可以准确检测.[结论]ARMS实时PCR方法分析速度快,操作简便,但它需要合适的反应条件及高质量模板.MALDI-TOF-MS分型方法虽然步骤较多,但准确度高,反应体系稳定并具有高通量潜力.     

改良分子信标-实时PCR快速检测志贺菌

目的：建立改良分子信标-实时PCR检测志贺菌的快速方法，应用于志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。方法：根据GenBank公布志贺菌ipaH基因的保守序列，设计引物和改良分子信标探针，建立实时PCR-改良分子信标检测体系，应用于对志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果：改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为93fg/μl，菌液灵敏度为64cfu／ml或2cfu／PCR反应体系，无交叉反应。此反应体系检测67株志贺菌，均出现特异的荧光信号。对细菌性食物中毒样本等共657份样品进行志贺菌检测，42份志贺菌实时PCR阳性，其中41份志贺菌细菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需2h～1d时间。结论：改良分子信标-实时PCR检测体系快速、灵敏度高，特异性强，可用于志贺菌食物中毒的快速诊断，为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段，对于提高肠道门诊的工作效率有重要意义。     

结核分枝杆菌新型间隔区寡核甘酸分型技术临床应用价值研究

目的评价基于多色荧光探针熔解曲线技术的结核分枝杆菌新型间隔区寡核苷酸分型技术(McSpoligotyping)的临床应用价值。方法在2013-2014年间,分别从河南省五个片区的10个市或县收集肺结核患者痰标本中分离培养的结核分枝杆菌502株,采用McSpoligotyping和传统的间隔区寡核苷酸分型技术(Spoligotyping)进行分型;比较两者的结果,对两种分型结果不一致的菌株进行基因测序。结果 502株结核分枝杆菌中McSpoligotyping和Spoligotyping检测结果一致的有485株(96.60%),不一致的有17株(3.39%);不一致菌株经基因测序,McSpoligotyping分型有15株(88.24%)与测序结果一致,Spoligotyping分型有2株(11.76%)与测序结果一致。结论 McSpoligotyping作为新型的基因分型方法,较传统Spoligotyping技术更为简便、快速,可以替代传统的Spoligotyping检测技术用于结核病的分子流行病学研究。     

实时荧光PCR同时检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157：H7

目的建立改良分子信标一双重实时荧光PCR同时检测金黄色葡萄球菌和大肠杆菌0157：H7,应用于细菌性食物中毒的快速诊断。方法根据GeneBank公布的金黄色葡萄球菌nuc基因序列和大肠杆菌O157：H7rfbE基因序列,设计引物和改良分子信标探针,建立改良分子信标一双重实时PCR检测体系。结果双重荧光PCR反应体系检测151株金黄色葡萄球菌和27株大肠杆菌O157：H7,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰。对8762份大便、食品等标本进行检测,315份标本金黄色葡萄球菌实时荧光PCR阳性,其中286份金黄色葡萄球菌培养阳性;31份标本大肠杆菌O157：H7实时荧光PCR阳性,其中26份大肠杆菌O157：H7培养阳性。从样品处理到检测结果仅需要时间2h～1d。结论改良分子信标-多重实时荧光PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157：H7食物中毒的快速诊断和肠道传染病的初筛,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

MALDI-TOF-MS结合引物延伸反应检测K-ras基因型方法的建立

目的:建立MALDI-TOF-MS结合引物延伸的方法检测K-ras基因12位密码子7种基因型的研究模型并探讨其应用价值.方法:以自行构建的K-ras质粒DNA为模板,经目的片断扩增,去磷酸化,再用两条未经修饰的普通引物,在dATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP混和物存在的体系中进行引物延伸反应,最后用MALDI-TOF-MS检测引物延伸产物质荷比(m/z),得到质谱图,根据质谱图中各个峰的峰值进行基因分型研究结果:用MALDI-TOF-MS结合引物延伸的方法,可以准确区分7种不同基因型.该方法可同时对384份样品进行检测结论:MALDI-TOF-MS结合引物延伸的方法准确度高,反应体系稳定并具有快速、高通量、自动化的特点,可能成为肿瘤早期诊断的检测方法.     

分子信标用于结核分枝杆菌的均相荧光PCR检测

1996年Ｔｙａｇｉ等〔1〕提出的分子信标是一种具有颈环构型的分子探针 ,用于ＰＣＲ扩增产物均相测定的原理是 ,在退火阶段 ,分子信标与生成的靶序列结合发出荧光 ,在延伸阶段 ,则脱离靶序列而不干扰扩增 ,随着循环次数的增加 ,与模板结合的分子信标的量亦增加 ,最终的荧光强度便与模板量成正相关。我们在原来“分子信标”原理基础上 ,对其设计思想进行了重要改进 ,合成出效率更高的分子信标 ,并自行研制了简便适用的荧光测定装置。本文报告用于结核分枝杆菌的检测结果。材料和方法菌株 :分枝杆菌属包括堪萨斯分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、耻垢…     

改良分子信标-双重实时荧光PCR快速检测SARS病毒

目的建立改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒的方法,用于SARS的早期诊断和动物溯源。方法利用改良分子信标技术、装甲RNA和双片段双色荧光技术,根据GenBank公布的SARS病毒聚合酶基因1b的阅读开放框架结构的保守序列,自行设计一对引物和探针,以部分临床标本的酶联吸附实验结果和传统细胞培养方法作为对照,建立分子信标检测SARS病毒的方法。对368份临床标本(咽漱液、血液、粪便、尿液)、52份细胞培养液和50份动物标本进行荧光PCR扩增。结果分子信标检测SARS病毒的方法灵敏度为10～100个拷贝ml,与流感病毒等呼吸道病毒无交叉反应。分子信标检测368份临床标本,20份阳性。其中确诊病例阳性率为21.27%(1047),确诊病例的咽漱液阳性率为43.48%,还分别从粪便和血清中检测到SARS病毒。52份细胞培养液,29份阳性,阳性率为55.77%。50份动物标本,23份阳性,阳性率为46%。结论改良分子信标-双重实时荧光PCR检测SARS病毒方法灵敏度高、特异性强,可用于SARS的临床早期诊断和动物溯源。     

快速检测副溶血弧菌及其毒力株方法的建立

目的利用实时PCR技术，建立检测副溶血弧菌及其毒力株的方法。方法根据副溶血弧菌的跨膜转录激活蛋白toxR基因序列设计引物和改良分子信标（ROX标记），建立检测所有副溶血弧菌菌株的方法。通过与文献报道的检测直接耐热溶血素（TDH）基因的实时PCR体系合并，建立了同时检测副溶血弧菌及其毒力株的双重实时PCR方法。结果通过对9个属的101株菌株进行试验，所有的52株副溶血弧菌均产生ROX阳性信号（toxR’），其余菌株均检测为阴性，其中46．2％（24／52）的副溶血弧菌产生HEX阳性信号（tdh^＋）。检测toxR基因的实时PCR体系DNA灵敏度为10～100fg／PCR体系，菌液灵敏度为59．2～592CFU/ml或2．96～29．6CFU／PCR体系。另外成功构建了双重实时PCR体系，能同时对副溶血弧菌的toxR和tdh基因进行检测。结论建立的双重实时PCR体系能同时检测副溶血弧菌及其毒力株，从而为食品的安全检疫提供有效手段。     

多色探针熔解曲线法在卡马西平不良反应相关基因检测中的临床评价

目的 对多色探针熔解曲线法（multicolor melting curve analysis,MMCA）用于卡马西平不良反应相关的HLA-B^*15：02基因检测进行临床评价。方法 收集厦门市中心血站1 147份厦门地区无偿献血者的外周静脉血样本,经基因DNA提取后,按双盲对照试验,分别应用MMCA法和HLA-SBT测序法对各样本进行HLA-B^*15：02基因检测,比较2种检测方法的符合率。对于检测结果不一致的标本,采用第三方Sanger测序和电泳验证,计算总符合率。结果 采用MMCA法共检出77份HLA-B^*15：02阳性标本,1 070份HLA-B^*15：02阴性标本。采用HLA-SBT测序法共检出74份HLA-B^*15：02阳性标本,1 070份HLA-B^*15：02阴性标本,以及3份无明确的分型信息的标本（仅显示为B^*15：VG-B^*15：CYS型）。该3份标本经Sanger测序以及电泳验证,确认为HLA-B^*15：02阳性标本。因此,MMCA法检测HLA-B^*15：02基因的阳性检出率为100%（77/77）,阴性检出率为100%（1 070/1 070）,总符合率为100%（1 147/1 147）。此外,在1 147份临床标本中共检出77份阳性结果,HLA-B^*15：02的携带率为6.7%（77/1147）,这与文献报道的数据基本一致。结论 MMCA法用于HLA-B^*15：02基因的检测,具有简便、快速、灵敏度高、特异性强等优点,可应用于卡马西平不良反应相关的HLA-B^*15：02基因的临床辅助检测。