沉默CtBP1基因逆转人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)的多药耐药性

目的:探讨短发夹式RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰羧基末端结合蛋白1(C-terminal-binding proteins 1,CtBP1)基因表达是否可以逆转多药耐药基因1(multidrug resistant gene 1,MDR1)介导的人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)的多药耐药性.方法:采用脂质体转染法将特异性的shRNA1和shRNA2及非特异性的shRNAHK质粒转染入人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)中,RT-PCR法检测各组细胞MDR1基因表达水平,Western印迹法检测各组细胞P糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的表达,MTT法测定各组细胞对多柔比星的敏感性变化.结果:RT-PCR结果显示,shRNA1组和shRNA2组细胞中MDR1基因被抑制,基因表达抑制率约50%;Western印迹结果显示,shRNA1组和shRNA2组细胞P-gp蛋白的表达水平显著降低;MTT检测发现,shRNA转染48和72 h时shRNA1组和shRNA2组细胞对多柔比星的敏感性增加(P<0.01).结论:沉默CtBP1基因可抑制人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1(ADR+/+)中MDR1基因和P-gp蛋白的表达,降低细胞的耐药性.     

CtBP1基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果的初步鉴定

目的：构建C-末端结合蛋白-1（CtBP1）基因RNA干扰（RNAi）的真核表达载体,转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,初步鉴定其干扰效果。方法：以人CtBP1基因为靶基因,以pGenesil-1质粒为载体,根据GenBank数据库提供的CtBP1基因核苷酸序列,选择设计两条siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带有绿色荧光蛋白（EGFP）基因、卡那霉素（Kanr）抗性基因及U6启动子的真核表达载体pGenesil-1中,构建针对CtBP1基因的shRNA真核表达载体,转化大肠杆菌DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析。确认载体构建成功后,用脂质体LipofectamineTM2000将重组质粒瞬时转染人子宫内膜癌耐药细胞株B-MD-C1（ADR＋/＋）,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,计数转染细胞数,计算转染效率,RT-PCR法检测载体对CtBP1基因的表达抑制效果。结果：构建针对CtBP1基因的pGenesil-1-CtBP1小发夹RNA（pGenesil-1-CtBP1-shRNA）,经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞表达绿色荧光蛋白（EGFP）,证实重组质粒己转染入细胞,转染效率达到60%-70%;RT-PCR结果显示B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞中CtBP1基因被特异抑制,基因表达抑制率达40%以上,与转染试剂对照组、空白对照组和阴性序列对照组间的差异均具有统计学意义（P均〈0.05）。结论：成功构建CtBP1基因的shRNA表达载体,可以有效抑制B-MD-C1（ADR＋/＋）细胞上CtBP1基因表达。为进一步研究CtBP1基因功能进而逆转肿瘤的多药耐药奠定基础。     

北豆根抗肿瘤有效成分的分离、纯化和活性分析

背景与目的：提取、纯化和鉴定北豆根抗肿瘤有效成分,并对纯化的成分作进一步的活性研究。材料与方法：常规方法制备北豆根水提液（RMW）和醇提液（RME）,对RME以3%HCl溶解、有机溶剂萃取和水相浓缩得到纯化提取物1、2、3（PE1、PE2、PE3）。用MTT法测定各提取物的抑瘤活性。根据抑瘤实验结果,通过凝胶和硅胶柱层析将PE2进一步分离得到两个单体化合物PF1和PF2。提取RME后的北豆根药渣用水回流提取,去除蛋白和鞣酸,再经乙醇沉淀和冷冻干燥得到多糖成分（RMP）。有效成分采用薄层层析和改良碘化铋钾显色对其进行鉴定分析。用电喷雾质谱ESI-MS检测单体化合物PF1和PF2的分子量。用紫外分光光度计检测RMP的纯度。结果：RMW和RME对K562、BGC823及TE13三种肿瘤细胞的增殖反应均有明显的抑制作用（P<0.01）,并有良好的量效及时效关系,RMP无此作用。进一步将RME应用三步法纯化得到PE1、PE2、PE3 。PE1和PE2对上述3种细胞的增殖反应均有明显的抑制作用（提高了近10倍）（P<0.01）,PE3无此抑制作用。有效成分分析结果显示,PE2主要含一系列生物碱成分。对PE2进一步分离得到两个化合物PF1和PF2,分子量分别为624和610。PF1和PF2对K562、BGC823及TE13细胞均有显著抑制作用（P<0.01）,PF2的抑制作用更强,PF2可导致上述细胞的形态学改变,表现为细胞体积变小,形态不规则等。PF2对肿瘤组织原代培养细胞增殖反应有较强抑制作用（P<0.01）。结论：北豆根水提物和醇提物在体外均有很强的抗肿瘤作用,醇提物的作用高于水提物。PE2是醇提物抗肿瘤的有效部位,其化学成分是生物碱;PF1和PF2均是醇提物抗肿瘤的有效成分,可能为蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱,PF2对肿瘤组织原代培养细胞也有较强的杀伤作用。北豆根多糖成分对K562等3种肿瘤细胞无抑制作用。     

B淋巴瘤细胞Syk基因启动子区甲基化及5-aza-CDR对细胞增殖和凋亡影响的研究

目的：探讨B淋巴瘤细胞Syk基因启动子区5′CpG甲基化情况及甲基化抑制剂5-氮杂脱氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytidine,5-az-a-CDR）对淋巴瘤细胞的作用机制。方法：采用RT-PCR方法检测人B淋巴瘤细胞株Raji和Ramos中Syk mRNA的表达,用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测Syk基因启动子区甲基化情况;采用MTT法检测5-aza-CDR对细胞增殖作用的影响,应用DNA凝胶电泳、流式细胞技术和电镜分析5-aza-CDR对B淋巴瘤细胞增殖、细胞周期和超微结构的影响。结果：Raji细胞Syk基因呈阳性表达,Ramos细胞未检测出Syk mRNA表达。Raji和Ramos细胞中均未检测到Syk基因启动子区的甲基化状态。5-aza-CDR可明显抑制Raji和Ramos细胞增殖,P〈0.05;并存在明显的量效和时效依赖关系。5-aza-CDR可诱导Raji和Ramos细胞凋亡,P〈0.05。DNA凝胶电泳检测结果显示明显的“DNAladder”,并且有明显的细胞凋亡超微结构变化。然而,5-aza-CDR对Raji和Ramos细胞周期未见明显影响。结论：在Raji和Ramos细胞中,Syk基因沉默可能与甲基化无关;5-aza-CDR能明显抑制B淋巴瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡,但对细胞周期无明显影响。     

CCK-8对胶原诱导型关节炎小鼠滑膜组织TNF-α、IL-6的影响

目的探讨八肽胆囊收缩素（CCK-8）治疗类风湿关节炎（RA）的可行性及机制。方法 DBA/1J小鼠60只,随机分为CCK-8高、中、低剂量组和对照组各15只。将CII完全乳化液于小鼠尾根部皮内多点注射（100μl/只）,第21天再次同剂量追加免疫一次,建立CIA模型。于第二次增强免疫同时,对照组腹腔注射生理盐水100μl/只;CCK-8高、中、低剂量组腹腔分别注射CCK-8 1、5、10 nmol/只,每天注射1次,连续注射7 d。采用酶联免疫反应法检测各组关节滑膜组织TNF-α和IL-6水平。结果 CCK-8各剂量组关节组织TNF-α和IL-6水平均明显低于对照组;中、高剂量组明显低于低剂量组（P均〈0.05）。结论 CCK-8能降低CIA小鼠TNF-α和IL-6水平,此可能是其治疗RA的机制之一。     

CCK-8对LPS诱导树突状细胞成熟的影响

目的: 观察八肽胆囊收缩素(CCK-8)对脂多糖(LPS)诱导树突状细胞(DCs)成熟的影响。方法: 采用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导法培养小鼠骨髓来源DCs,在LPS诱导其成熟过程中用不同浓度的CCK-8进行干预,采用流式细胞分析技术检测DCs表面主要组织相容性复合物II(MHC II)、分化群80(CD80)和分化群86(CD86)的表达;ELISA法检测DCs培养上清中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量;MTT法检测CCK-8处理DCs对同种异体T细胞增殖反应的影响。结果: CCK-8剂量依赖性地抑制LPS诱导DCs表面CD80、CD86和MHC II表达(P<0.01, P<0.05 );CCK-8抑制LPS诱导DCs分泌IL-1β、IL-6和TNF-α(P<0.01);并且,CCK-8降低LPS诱导DCs刺激同种异体T淋巴细胞增殖的活性(P<0.05,P<0.01)。结论: CCK-8对LPS诱导DCs成熟过程中的细胞表型、细胞因子分泌和抗原提呈功能有抑制作用,提示CCK-8有可能在抗感染和抵抗自身免疫性疾病过程中发挥重要调节作用。     

柴连疏肝合剂治疗失眠症(肝郁化火型)的临床研究

目的:观察柴连疏肝合剂治疗肝郁化火型失眠症的临床疗效.方法:将60例失眠症(肝郁化火型)患者按照自愿原则分为治疗组和对照组,治疗组予以柴连疏肝合剂,2次/d,1袋/次,200 mL/袋;对照组予以艾司唑仑,1次/d,1 mg/次,睡前口服.疗程2周.2组患者在治疗前及治疗2周后各进行一次匹兹堡睡眠质量指数(PSQI)量...     

王志刚主任医师治疗糖尿病盗汗验案举隅

糖尿病盗汗是糖尿病常见的并发症之一,对患者生活影响较大。王志刚主任医师善用审因辨证、滋阴固本、从肝去火的理论,应用中药治疗糖尿病合并盗汗,临证化裁经方、灵活辨证,疗效显著。