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目的 探讨HepaRG细胞移植对鼠特异性Fas抗体诱导的急性肝衰竭小鼠的治疗作用和人肝细胞异种移植的策略.方法 利用特异性鼠抗Fas抗体(Jo2 mAb)腹腔注射,剂量为0.3 mg/kg,诱导20只SCID小鼠制备急性肝衰竭模型,24 h内按照实验动物随机数字表分组方法 ,经脾移植2×106HepaRG细胞的小鼠为实验组(10只),未经HepaRG细胞移植的小鼠为对照组(10只).观察小鼠的存活率、肝脏功能、肝组织变化情况.实验组移植4周免疫组化检测肝组织人白蛋白、人CK18、人Hep Par1的表达,免疫荧光检测人白蛋白的表达.结果 实验组小鼠有9只存活超过4周,而对照组小鼠3 d内先后死亡9只,实验组血清ALT和AST趋于正常,显著低于对照组(P<0.01),且存活时间显著高于对照组(P<0.01).实验组经HepaRG细胞移植能避免Jo2 mAb所致肝组织出血、坏死,移植后4周免疫组化可见人白蛋白、CK18、Hep Par 1阳性表达细胞,肝组织免疫荧光可见人白蛋白阳性细胞的表达.结论 移植HepaRG细胞可治疗Jo2mAb腹腔注射小鼠诱导的急性肝衰竭,HepaRG细胞不仅在小鼠肝内存活,且得以增殖. 相似文献
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目的 移植bcl-2转基因HepaRG细胞到小鼠体内,并联合使用Jo2抗体诱导鼠肝细胞凋亡策略,促进人鼠嵌合肝中人肝细胞的增殖.方法 SCID鼠经脾移植2×106 bcl-2转基因HepaRG细胞,移植后1d始腹腔注射0.2mg/kg Jo2抗体,每周1次,持续10周为实验组;移植未转染bcl-2基因的HepaRG细胞,同样给予Jo2 抗体腹腔注射为对照1组,移植未转染bcl-2基因的HepaRG细胞,未腹腔注射Jo2抗体为对照2组,建立人鼠嵌合肝动物模型.从2周开始,后4、8、12、16、20、24周,分别采用免疫组化、免疫荧光和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同时相点实验组和对照组嵌合肝中肝组织人清蛋白以及人清蛋白mRNA,并用酶联免疫法(ELISA)定量检测鼠血清人清蛋白的含量.结果 实验组和对照组小鼠均能存活至24周,鼠肝组织和血清中均能检测到清蛋白的表达.实验组肝组织和血清人清蛋白的表达均可持续到24周,人血清清蛋白高峰值为95.32ng/mL,出现在16周;而对照1组肝组织和血清人清蛋白的表达可持续到20周,人血清清蛋白高峰值为42.37ng/mL,出现在12周;对照2组肝组织和血清人清蛋白的表达可持续到12周,人血清清蛋白高峰值为22.91ng/mL,出现在8周.结论 利用bcl-2抗Fas凋亡特性,转染bcl-2基因的HepaRG细胞移植并联合小剂量Jo2抗体腹腔注射SCID鼠,有利于人鼠嵌合肝中人肝细胞的增殖和存活. 相似文献
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目的 建立人源性永生化肝细胞.方法 利用含有SV40T和EGFP基因的双顺反子逆转录病毒表达载体pLNCTIGlox,转染包装细胞PT67;取病毒上清液感染原代培养的人胎肝细胞,用G418筛选成功转导的永生化细胞系;用细胞计数法测定永生化细胞增殖特性,免疫细胞化学染色检测肝细胞特征蛋白表达,放免法和自动生化仪检测清蛋白和尿素氮合成功能.结果 获得的一个细胞系命名为LC-1,其细胞群体倍增时间约为17h,可表达清蛋白、CK18肝细胞特征和CK19等胆管特征蛋白,具有清蛋白与尿素氮合成功能.结论 成功建立了具有良好的增殖能力、分化状态、肝细胞生物学特征的永生化肝细胞系. 相似文献
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HBV感染的人鼠嵌合肝动物模型的建立 总被引:8,自引:2,他引:8
乙型肝炎病毒 (HBV)感染所致的乙型病毒性肝炎 ,发病率高、危害大。但因缺乏有效的体内研究系统而阻碍了对病毒性肝炎防治的革新与发展。我们采用人胎肝细胞诱导胎鼠对人肝细胞产生免疫耐受的方法 ,建立人鼠嵌合肝 (Chimerichumanliverinnormalrats)。而后接种HBV感染血清 ,旨在建立HBV感染的人鼠嵌合肝动物模型。现对我们目前的研究进展作一阶段性报道。1 材料与方法1 1 动物 Wistar孕鼠 ,体质量 15 0~ 2 5 0g ,孕龄 14~ 18d ,由本校实验动物中心提供。免疫组化S P试剂盒、单克隆… 相似文献
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目的探讨脂质体和电穿孔法在HBV X基因转染L02细胞中的差别及X基因蛋白产物对CⅡTA和HLA-DR表达的影响。方法构建HBV X基因重组表达质粒,通过电穿孔和脂质体法转染人正常肝细胞L02细胞,以绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)表达水平评价转染效率,流式细胞技术检测L02细胞HBV X蛋白的表达水平。RT-PCR、流式细胞技术及western-blot分析L02细胞、转染空载体以及转染HBV X基因重组表达质粒的L02细胞CⅡTA和HLA-DR的表达差别。结果采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000的转染效率为(6.4±3.5)%,显著低于电穿孔法(41.46±5.8)%,P<0.01。脂质体法转染的L02细胞HBV X蛋白表达水平为(5.1±3.9)%,显著低于电穿孔方法(37.5±4.1)%表达,P<0.01。转染了HBV X基因重组表达质粒的L02细胞检测到CⅡTA和HLA-DR mRNA和蛋白表达,而L02细胞本身及转染空载体的L02细胞未检测到CⅡTA和HLA-DR的表达。结论 HBV X基因真核表达载体pHBx-IRES2-EGFP通过电穿孔法转染L02细胞较脂质体法有明显较高的转染效率和更高的目的基因的表达,HBV X基因诱导了L02细胞中CⅡTA和HLA-DR的表达。 相似文献
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目的:扩增丙型肝炎病毒(HCV) 1b型5′端5223 bp半基因组. 方法:取5份HCV 1b血清标本,采用3种RNA提取方法,比较几种逆转录酶及逆转录条件,选取不同Taq酶进行长链RT-Nested PCR反应体系及循环条件的筛选和优化,利用最佳的模板提取方法及优化的RT-PCR反应条件扩增出5′端长度为5223 bp(5223 bp)半基因组. 结果:Trizol法可以获得完整的RNA模板,适合长链的扩增;应用ReverTra Ace-a-TM酶和SuperScriptTMⅡ,反应条件为42℃ 10 min后,42℃ 2 min,48℃ 2 min,30个循环,然后75℃,10 min;可获得完整的cDNA模板;TaKaLa LA TaqTM和Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity采用两种扩增条件:①94℃变性2 min,94℃ 30 s,62℃ 30 s,72℃ 4.5 min,扩增30个循环;②94℃变性2 min,94℃ 15 s,68℃ 5 min,扩增5个循环,然后94℃ 15 s,68℃ 5 min(每个循环延长10 s), 扩增20个循环,最后72℃延伸10 min,均可获得HCV 1b型5′端5223 bp半基因组的阳性结果,TaKaLa LA TaqTM扩增效果最好;PCR产物经核苷酸序列测定证实为HCV 1b型. 结论:通过各种条件的优化,成功地实现了5′端半基因组的扩增,为下一步全长质粒及复制子的构建打下了基础. 相似文献
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构象敏感凝胶电泳用于检测乙型肝炎病毒P区核苷类似物耐药准种的初步研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的建立经济、实用、准确的乙型肝炎病毒准种分析方法。方法采用"PCR-克隆-测序"的方法,对2例血清样本的各60个克隆测序,χ2检验分析所研究克隆毒株的数量对准种组成反映准确性的影响;用建立的构象敏感凝胶电泳(CSGE)法区分克隆目的片段,比对CSGE结果与测序结果的一致性。结果对于优势准种比例的反映检测15个克隆以上(χ2=2.700,P=0.100>0.05)、对劣势株的检出检测30个以上则与检测60个克隆无统计学差异(χ2=2.411,P>0.05);比较8个样本共270个克隆的CSGE及测序结果,两者表现出良好的对应性(准确率达98.9%)。结论用"PCR-克隆-CSGE-测序"的方法视不同需求检测15或30个克隆可准确反映1份血清样本中HBV准种的组成和分布。 相似文献
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脂肪源性干细胞体外成骨特性的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
目的探讨兔脂肪源性干细胞体外成骨分化能力。方法取3个月龄新西兰白兔颈背部皮下脂肪组织,型胶原酶消化获得细胞。绘制细胞生长曲线,采用免疫细胞荧光法检测细胞表面抗原CD44、CD45;分别加入条件培养液对所获得细胞进行成骨成脂诱导,并分别进行形态学、碱性磷酸酶、钙盐沉积和油红O染色相关检测;将脂肪源性干细胞分为成骨诱导组和非成骨诱导组,分别于诱导后1、2、3、4周检测两组的碱性磷酸酶和钙离子浓度并作统计分析。结果 a)所获细胞CD44阳性表达,CD45阴性表达;所绘制的生长曲线成典型的"S"型。b)在诱导条件下,碱性磷酸酶及钙盐沉积均呈阳性表达,油红O染色为阳性。c)碱性磷酸酶浓度在诱导组与非诱导组之间存在组间差别,在各个时间点诱导组碱性磷酸酶浓度均高于非诱导组(P〈0.05,n=5);诱导组碱性磷酸酶浓度在不同诱导时相其浓度变化趋势不同(P〈0.05,n=5);钙离子浓度在诱导组与非诱导组之间存在组间差别,在各个时间点诱导组钙离子浓度高于非诱导组(P〈0.05,n=5)。诱导组钙离子浓度在不同诱导时相其浓度变化的趋势不同(P〈0.05,n=5)。结论脂肪干细胞的易分离培养、增殖快和良好的成骨诱导活性完全符合对种子细胞的要求,是一种理想的骨组织工程种子细胞。 相似文献
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可回复性肝细胞永生化载体pCTGTKlox的构建、鉴定、转染与表达 总被引:3,自引:0,他引:3
目的构建可回复性永生化逆转录病毒载体,为肝细胞可回复性永生化奠定基础。方法扩增加强型绿色荧光蛋白(EGFP)及胸腺激酶(TK)并采用重叠延伸拼接法(SOE)连接EGFP和TK,将EGFP-TK融合基因亚克隆至pBABE-puro-lox,构建成新载体pBGTKlox,再将永生化基因SV40T连接至pBGTKlox,构成新载体pBTGTKlox,最后将雌激素受体与重组酶融合基因(Cre-ER)连接至pBTGTKlox,构成新载体pCTGTKlox。将pCTGTKlox和pPDF15质粒共转染包装细胞PT67,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。免疫组化染色检测SV40T基因的表达。结果成功构建包含EGFP-TK、SV40T、Cre-ER及重组序列loxP的新载体pCTGTKlox,经酶切鉴定证实为重组阳性体,经测序验证无核苷酸突变。pCTGTKlox转染PT67细胞24h后,荧光显微镜下可见散在多处绿色荧光。免疫组化染色显示细胞胞核呈阳性染色。结论成功构建并表达可回复性永生化逆转录病毒载体pCTGTKlox,为细胞的可回复性永生化提供了一种良好的新型载体。 相似文献