模拟微重力培养骨髓间充质干细胞定向诱导复合改良纤维蛋白原支架修复免关节软骨缺损

背景：模拟微重力培养系统通过模拟细胞生存的体内微重力环境,使细胞承受较低的剪切力,提高细胞内外、细胞间物质传递效率,从而提高细胞分化质量。目的：观察微重力培养环境在构建组织工程模块修复关节软骨缺损中的作用。设计、时间及地点：体外实验采用自身对照;体内实验采用随机分组比较,于2007-12／2008-06在广东省构建与检测实验室及南方医院动物实验中心进行。材料：3周普通级龄新西兰兔1只用于骨髓间充质干细胞培养：3月龄新西兰兔48只用于体内验证实验。方法：以纤维蛋白胶粉、凝血酶、氯化钙、抑肽酶、氨甲环酸制备纤维蛋白原支架。体外培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞3周,使之吸附于改良纤维蛋白原支架上在微重力环境下三维立体培养3周。48只兔做软骨钻孔制备软骨缺损动物模型,每只兔4孔。实验分为4组,每组48孔,微重力培养组在孔内植入微重力培养下的软骨细胞组织模块;普通培养组在孔内植入普通培养下的软骨细胞组织模块;单纯支架组在孔内植入空白支架;空白组孔内不植入任何材料,分别于2,6,12周处死动物,取相应标本。主要观察指标：通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学检测微重力培养环境在三维立体培养对软骨细胞增殖及功能的影响,以及用组织工程学评分检测微重力环境下培养的软骨模块对缺损的修复效果。结果：模拟微重力培养条件下构建的模块体外培养3周,细胞数量明显增多,并分泌较多的细胞基质,包裹在软骨细胞周围。组织工程学评分显示微重力培养组修复软骨缺损的效果明显好于其他组。结论：模拟微重力培养环境对三维立体培养软骨细胞模块有比较良好的效果。     

miR-100对骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响

[目的]观察miR-100对不同骨肉瘤细胞系的表达差异,研究miR-100对骨肉瘤细胞MG-63增殖、侵袭迁移能力的影响。[方法]采用qRT-PCR检测miR-100在骨肉瘤细胞系中的表达差异。通过脂质体2000转染说明对骨肉瘤细胞MG-63进行转染操作,分别构建miR-100过表达和miR-100阴性对照组。转染骨肉瘤成功后,通过CCK-8实验检测miR-100对骨肉瘤细胞增殖能力的影响,同时Transwell实验检测骨肉瘤细胞侵袭、迁移能力变化。[结果]miR-100在骨肉瘤细胞系中表达差异显著(P0.05),且差异具有统计学意义;相比miR-100NC组,过表达miR-100增殖、侵袭、迁移能力明显下降(P0.05),且差异具有统计学意义。[结论]miR-100在骨肉瘤中呈现低表达;过表达miR-100抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移能力。miR-100可能会成为未来骨肉瘤治疗的潜在靶点。     

miR-200c通过AKT2对骨肉瘤细胞增殖的影响

[目的]探讨过表达mi R-200c通过对AKT2的相关调控对骨肉瘤细胞增殖能力的影响,为骨肉瘤的靶向治疗提供新的依据。[方法](1)检测mi R-200c在正常成骨细胞和4种骨肉瘤细胞株中的表达差异;(2)将mi R-200c转染至骨肉瘤细胞株MG-63中,构建稳定过表达mi R-200c骨肉瘤细胞株;(3)预测mi R-200c与AKT2基因的相关结合位点,构建相应的荧光素酶基因表达载体,连同过表达mi R-200c质粒共转染至骨肉瘤细胞株MG-63中;(4)检测两组骨肉瘤细胞株MG-63荧光素酶活性;(5)检测两组骨肉瘤细胞株MG-63中AKT2表达水平;(6)观察两组骨肉瘤细胞株MG-63的增殖能力。[结果](1)与正常成骨细胞(NHOst)相比,mi R-200c在4种骨肉瘤细胞株(HOS、U2OS、Saos-2、MG-63)中表达量明显降低(P0.05);(2)与mi R-NC组相比,过表达mi R-200c组骨肉瘤细胞株MG-63中AKT2 3′-UTR序列结构野生型(WT)的荧光素酶活性明显降低(P0.05),而突变型(MUT)的荧光素酶活性无明显差异(P0.05);(3)与mi R-NC组相比,过表达mi R-200c的骨肉瘤细胞株MG-63中AKT2表达明显降低(P0.05);(4)与mi R-NC组相比,过表达mi R-200c骨肉瘤细胞株MG-63增殖能力明显下降(P0.05)。[结论]mi R-200c在骨肉瘤细胞中低表达,而过表达mi R-200c通过靶向调控AKT2表达抑制骨肉瘤细胞的增殖。因此mi R-200c可能对未来骨肉瘤的预防及治疗提供新的策略。     

二甲双胍对小鼠激素性股骨头坏死影响的实验研究

目的：探讨二甲双胍对小鼠激素性股骨头坏死的防治效应。方法：昆明小鼠36只,随机分为3组（n＝12）：空白对照组A,模型组B,二甲双胍组C,B、C组按10 mL／kg腹腔注射马血清,间隔2周后按5 mL／kg再次腹腔注射马血清,第2次注射马血清同时肌肉注射醋酸泼尼松龙45 mL／（kg·d）,共5 d,制备股骨头坏死模型。应用激素同时B组灌服生理盐水10 mL／（kg·d）,C组按0．2 g／（kg·d）的剂量餐后灌服二甲双胍。A组不制备模型,于同时间点肌肉注射和灌服等量生理盐水。各组于造模前、造模后2、4、6周行血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血管性血友病因子（VWF）、纤溶酶原激活物抑制剂－1（PAI-1）含量检测,于造模后2、4、6周各组随机取4只小鼠处死,组织形态学观察股骨头情况。结果：3组各时间点股骨头外观、形态及关节软骨面均正常。B组较C组空骨陷窝率明显增高（P＜0．05）,A、C组间无明显差异（P＞0．05）。TC、TG测定结果显示C组2、4、6周显著低于B组（P＜0．05）,但高于A组（P＜0．05）。VWF、PAI-1测定结果显示C组2、4周明显低于B组（P＜0．05）,6周差异无统计学意义（P＞0．05）,A、C组间比较差异均无统计学意义。结论：二甲双胍可减轻激素所致的高脂、高凝、低纤状态,从而有效预防小鼠激素性股骨头缺血坏死。     

模拟微重力培养在骨和软骨组织工程中的应用

骨和软骨组织工程主要致力于骨和软骨的形成和再生,通过建立细胞与生物材料的三维复合物,构建具有生物活性的组织,进而对受损的骨和软骨组织进行形态结构和功能的重建以求达到永久性替代.目前模拟微重力条件下骨和软骨组织工程的研究表明,微重力培养环境有利于细胞体外增殖和分化,并维持细胞的表型;有利于细胞和材料的三维立体复合;有利于构建的组织更接近于活体.因此微重力细胞培养为骨和软骨组织工程的研究开辟了新的道路.     

软骨细胞复合胶原/壳聚槲/β-磷酸三钙层状梯度修复体的体外培养

背景:关节软骨缺损的修复涉及到软骨和软骨下骨的双重修复,需要将骨与软骨组织工程结合起来,构建骨软骨双层支架,或者在同一支架上构建组织工程化骨软骨.目的:观察胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体对软骨细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响,评价其作为关节软骨工程支架的可行性.时间及地点:体外细胞学实验,于2007-12/2008-06在广东省构建与榆测实验室进行.材料:以胶原、壳聚糖、β-磷酸三钙制备复合支架,上层以胶原/壳聚糖为主,下层以胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙为主,孔隙率≥90%,孔径100 μm.方法:体外培养新西兰大白兔软骨细胞并成骨诱导3周,使之吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上三维立体培养3周.主要观察指标:通过生长曲线、倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测支架在三维立体培养对软骨细胞的表型、增殖及功能的影响.结果:修复体/细胞体外培养3周,修复体上细胞数量明显增多,并分泌细胞基质,包裹在软骨细胞周围,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色阳性.结论:胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体的细胞相容性良好,有望成为一种比较理想的关节软骨组织工程支架材料.     

猪源性异种骨支架材料的生物相容性

目的:异种骨来源广泛,价格低廉,经过适当处理既能保留骨诱导作用,并作为骨支架使其具有骨传导作用。检测猪源性骨支架材料与人源性骨支架材料的生物相容性有无明显差异,为猪源性骨支架材料取代人源性骨支架材料提供实验依据。方法:实验于2006-08/2007-03在南方医科大学人体解剖学系实验室(广东省组织构建与检测重点实验室)完成。①实验材料:人源性、猪源性骨支架材料(为课题组前期制备);脂肪源间充质细胞(前期培养)。②实验方法及评估:体外细胞毒性实验:提取人源性、猪源性骨支架材料浸提液,用此浸提液培养脂肪源间充质细胞,并用无浸提液的DMEM培养基做对照,镜下观察细胞生长状况,流式细胞术检测细胞生长周期;人源性、猪源性骨支架材料皮下植入试验:于8只新西兰大白兔皮下,脊柱左侧植入异种骨支架材料,右侧植入同种异体骨支架材料。分别于4,8,12,16周将植入材料连同周围组织取出,进行组织切片观察及电镜观察。对动物处置符合动物伦理学标准。结果:①体外细胞毒性实验结果:在同一时间点,浸提液组、正常培养组细胞生长状况均良好,未见明显细胞抑制;流式细胞术检测细胞周期,3组细胞G1、G2、S期细胞百分率差异无统计学意义(P>0.05)。②皮下植入实验结果:组织切片光镜及电镜观察,4周两种植入材料周围均见结缔组织包绕,有大量巨噬细胞、浆细胞、中性粒细胞、单核细胞浸润,材料表面光滑,与结缔组织界限清楚;8周时炎症反应减轻,可见部分材料开始降解,材料表面稍显粗糙,有少量结缔组织长入材料内部;12周炎症反应基本消失、材料降解明显、异位成骨趋势明显,材料表面更加粗糙,周围有大量结缔组织长入材料;16周均无炎症反应,两种材料大部分降解,并且猪源性骨支架材料降解更为迅速,均有新骨形成,材料表面粗糙程度较12周时为甚,骨支架材料基本消失。结论:猪源性异种骨支架材料有良好的生物相容性,与人源性异种骨支架材料无明显差别。     

胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状修复体负载骨髓间充质干细胞体外培养*★

目的：观察胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体对经诱导骨髓间充质干细胞的吸附作用及对细胞生物学性状的影响，评价其作为关节软骨工程支架的可行性。 方法:实验于2007-09/2008-03在广东省组织工程构建与检测实验室进行。①实验方法：以胶原、壳聚糖、β-磷酸三钙制备复合支架，孔隙率≥ 90%，孔径100 μm；体外培养新西兰大白兔骨髓间充质干细胞并成骨诱导3 周，经检测诱导成功后，使之吸附于多孔胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体上三维立体培养4周。②观察指标：通过倒置相差显微镜、组织学、扫描电镜及免疫组织化学检测修复体三维立体培养对成骨细胞的表型、增殖及功能的影响。 结果：①骨髓间充质干细胞经成骨诱导，检测碱性磷酸酶染色阳性，钙结节染色阳性，证实诱导成功。②胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙复合支架亲水性好，经诱导的骨髓间充质干细胞吸附于支架表面24 h后,顺孔隙迁徙至支架内部，倒置显微镜和扫描电镜观察显示细胞在孔壁贴附良好。③组织学及免疫组织化学检测表明成骨细胞在复合支架上增殖和表型维持稳定，能分泌细胞外基质，Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性。　 结论：胶原/壳聚糖/β-磷酸三钙层状梯度修复体与经成骨诱导的骨髓间充质干细胞相容性良好，为修复关节软骨下层骨的进一步研究提供了实验依据。     

去卵巢大鼠骨组织中肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β及白细胞介素6水平与骨质疏松的关系

BACKGROUND: It has found that secretions of tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin 1β (IL-1β) and interleukin 6 (IL-6) are closely related to osteoporosis     

白细胞介素1β对组织工程化椎间盘细胞基质金属蛋白酶13表达的作用

[目的]观察不同浓度白细胞介素1β对组织工程化椎间盘细胞基质金属蛋白酶13表达的影响.[方法]将体外培养的兔组织工程化椎间盘细胞随机分为1、10、100 μg/L浓度白细胞介素1β作用组及空白对照组,免疫组织化学检测基质金属蛋白酶13表达.[结果]1、10、100 μg/L浓度白细胞介素1β组基质金属蛋白酶13阳性表达率均较对照组增高(P＜0.05).随着白细胞介素1 β浓度的增高,基质金属蛋白酶13阳性表达率显著升高,100 μg/L浓度高于1、10 μg/L浓度组(P＜0.05),10 μg/L浓度组高于1.μg/L浓度组(P＜0.05).[结论]白细胞介素1β对兔组织工程化椎间盘细胞基质金属蛋白酶13表达的调控作用随其浓度的升高而呈正相关.