慢病毒载体介导的鼠基因工程调节性T细胞对小鼠移植物抗宿主病的作用研究

目的 通过慢病毒载体介导的鼠叉状头螺旋转录因子(Foxp3)基因表达构建鼠基因工程调节性T细胞(Tr),探讨输注基因工程Tr细胞对小鼠异基因骨髓移植后移植物抗宿主病(GVHD)的影响.方法 利用慢病毒载体介导,将鼠Foxp3基因转导入BALB/c小鼠的CD4+CD25-T淋巴细胞,即为基因工程Tr细胞.建立小鼠异基因骨髓移植模型,在移植时联合输注基因工程Tr,通过受鼠移植后生存期、组织病理学改变、炎性细胞因子浓度等指标评价其防治GVHD的作用.并与单纯照射组、移植对照组、空载体对照组相比较.结果 单纯照射组、移植对照组、工程Tr组和空载体对照组小鼠存活时间分别为(8.8±0.6)d、(36.7±2.5)d、(51.6±4.0)d和(34.1±2.3)d,工程Tr组小鼠存活时间明显长于其他各组(P＜0.05).移植对照组及空载体对照组小鼠肝脏、皮肤和小肠病理切片均存在GVHD病理改变,工程Tr组长期存活小鼠的肝脏、皮肤和小肠常规病理切片结构基本正常,未见GVHD病理表现.移植后移植对照组、工程Tr组、空载体对照组受鼠血清IFN-γ、IL-2和TNF-α浓度在21～28 d时达高峰,工程Tr组在21 d时IFN-γ、IL-2和TNF-α浓度高峰较其他两组为低(P＜0.05).结论 小鼠异基因骨髓移植时联合输注基因工程Tr细胞可通过减少受鼠移植后炎性细胞因子的分泌有效减少GVHD的发生,减轻其严重程度.     

造血干细胞移植预处理中内皮损伤与修复启动研究

目的 探索异基因造血干细胞移植预处理过程中,照射在摧毁造血系统的同时,对组织器官血管内皮的损伤及修复的启动.方法 将20只6～8周龄雌性BALB/C小鼠随机分2组:对照组(n=10),为未照射小鼠;单纯照射组(n=10),小鼠经8.5 Gy照射,剂量率为0.57 Gy/min,距离为2.33 m.照射后,两组分别取小鼠外周血,用流式细胞术分析两组小鼠外周血的内皮细胞(ECs,CD31+CD133-CD45-)和内皮祖细胞(EPCs,CD31+CD133+CD45low/-)细胞比例.照射后第5天HE切片观察两组小鼠组织结构损伤,电子显微镜观察损伤的超微结构变化.结果 ①照射组的ECs和EPCs细胞比例升高,第3～5天达峰值,且可维持4天高水平,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05).②HE切片中照射组的肝细胞有广泛炎症浸润,而内皮损伤不明显.电子显微镜下肝窦状间隙损伤,血小板聚集到暴露的胶原纤维上,ECs和基底膜的连接被破坏.结论 异基因造血干细胞移植中预处理因素照射可引起内皮损伤,该损伤可引起EPCs动员至外周,参与内皮损伤的修复.     

猪血细胞表面多糖抗原α-Gal与人ABO血型抗原的比较

目的 探讨猪血细胞表面多糖抗原α-Gal与人ABO血型抗原的相似性.方法 人全血A、B、O、AB 4种血型的健康人的新鲜血,肝素抗凝,1 800 r/min离心,取白细胞富集层,利用confocal及流式细胞技术（FCM）检测猪及人ABO 4种血型血细胞与BSI-B4-FITC结合的情况.结果 以A型血细胞为阴性对照,4种血型血小板、RBC、单个核细胞均为阴性,而粒细胞,B型有14%为（＋）,AB型约有8%为（＋）,O型约有2%为（＋）.结论 4种ABO血型抗原中B抗原与α-Gal的结构最为相似.     

Ca~(2+)-NFAT信号通路在骨髓基质细胞介导的费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病耐药中的作用

目的:探讨Ca~(2+)-活化T细胞核因子(nuclear factors of activated T cells,NFAT)信号通路在骨髓基质细胞介导的费城染色体阳性(Ph~+)急性淋巴细胞白血病(ALL)耐药中的作用。方法:聚合酶链式反应检测Sup-B15细胞及Ph~+ALL原代细胞NFAT mRNA的转录水平;流式细胞术检测Sup-B15细胞P-糖蛋白表达;Western blot检测Sup-B15细胞NFAT蛋白的变化;Annexin V/7-AAD标记细胞,流式细胞术检测细胞凋亡;Fluo 3-AM染料标记细胞,流式细胞术检测共培养后白血病细胞Ca~(2+)浓度变化。结果:Sup-B15细胞及Ph~+ALL原代细胞中均可检测到NFAT表达;流式细胞术未检测到Sup-B15细胞表达P-糖蛋白;临床应用的治疗浓度(2.5和5μmol/L)的环孢素(CAS)可明显抑制NFAT蛋白表达,其中5μmol/L CAS抑制作用更明显;临床治疗浓度CAS(2.5和5μmol/L)对Sup-B15细胞的凋亡无明显影响,而较高浓度CAS(10μmol/L)可诱导Sup-B15细胞的凋亡。骨髓基质细胞OP9可使Sup-B15细胞及Ph~+ALL原代细胞对伊马替尼的敏感性下降;与骨髓基质细胞OP9共培养后Sup-B15细胞Ca~(2+)浓度升高,总NFAT蛋白水平及核蛋白水平均增加;在共培养体系中加入环孢素抑制Ca~(2+)-NFAT信号通路,可降低OP9对Sup-B15细胞的保护作用。结论:Ca~(2+)-NFAT信号通路有助于Ph~+ALL细胞的存活,骨髓基质细胞_+可通过活化Ca~(2+)-NFAT信号通路介导Ph~+ALL细胞对IM的耐药。     

HSCs移植预处理对骨髓微环境损伤的研究

目的 研究异基因造血干细胞(HSCs)移植预处理-清髓照射对受者骨髓微环境的损伤.方法 20只BALB/C小鼠随机分为:正常对照组(10只);单纯照射组(10只),予8.5 Gy照射,剂量率0.57 Gy,距离2.33m.显微镜下计数外周血中白细胞的变化,流式细胞术分析外周血中内皮细胞(ECs)的变化;病理和电镜观察骨髓微环境的损伤.结果 照射后外周血中白细胞减少,ECs升高,第5天达高峰,持续至第7天,与正常组相比,差异有统计学意义(P<0.05).照射后3 d光镜下观察骨髓微环境中大量出血;电镜下ECs和基底膜间被损坏.结论 移植预处理中的清髓照射可引起严重的骨髓微环境中内皮损伤.     

Ⅱ类抗原反式激活因子与HLA-DR抗原的关系及其意义

本研究探讨Ⅱ类抗原反式激活因子（CIITA）和人类白细胞抗原（HLA-DR）表达时相的关系和差异，及STAT1-α反义寡核苷酸（STAT1-αAS）对CIITA和HLA-DR的抑制作用。分离健康志愿者外周血T淋巴细胞，给予不同剂量干扰素-γ（IFN-γ）后，用RT-PCR法检测CIITA mRNA，Western blot分析HLA-DR抗原表达，然后给予不同浓度STAT1-αAS和STAT1-α寡核苷酸有义链（STAT1-αS），再次检测CIITAmRNA和HLA—DR的表达。结果表明：CIITA mRNA在IFN-γ作用后5小时开始表达，14小时达峰值；HLA-DR在28小时后可被检测出，52小时达高峰。5、10和20μmol／LSTAT1-αAs作用于细胞后，CIITA mRNA的表达显著低于对照组（P〈0．01），而在S组明显高于AS处理组（P〈0．01），S组与对照组间无显著差异；HLA-DR的表达可被STAT1-αAS抑制，AS组仅为对照组的64．3％（P〈0．01），S组与对照组间仍无差异；STAT1-αAS作用后，HLA-DR变化同CIITA。结论：CIITA mRNA表达与HLA-DR表达呈正相关且早于后者；STAT1-αAS可特异性抑制CIITA和HLA-DR的表达，并能预防T淋巴细胞激活．CIITA在移植免疫病因中起重要作用。     

X射线和γ射线预处理对小鼠异基因骨髓移植后造血免疫重建的影响

目的 研究X射线和γ射线两种预处理方式造成的损伤程度的差别,以及对造血、免疫重建的影响,确定适用于异基因造血干细胞移植的预处理照射方式.方法 对受鼠分别使用直线加速器X射线或60Coγ射线进行致死剂量(总剂量为7.0 Gy)全身照射后,给予相同数量供鼠骨髓细胞移植.观察受鼠移植后的生存时间、重要脏器(肝、小肠和肺)病理...     

Prdm1基因敲除小鼠的繁育和基因型鉴定

本研究目的是繁育和鉴定prdm1基因敲除的小鼠,为进一步研究Blimp-1蛋白的功能奠定基础。将所引进的2种转基因纯合子小鼠B6.prdm1flox/flox和B6.Lck-Cre进行饲养并繁殖,繁殖成功后获得第1代小鼠,将第1代小鼠再次进行交配获得基因型为:B6.prdm1wild/wild.Lck-Cre、B6.prdm1wild/wild、B6.prdm1flox/flox.Lck-Cre、B6.prdm1flox/wild.Lck-Cre、B6.prdm1flox/flox、B6.prdm1flox/wild。提取第2代小鼠基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增Cre和loxp基因片段后琼脂糖凝胶电泳分别检测cre和loxp基因组DNA的大小。取基因型为B6.prdm1flox/flox.Lck-Cre即为条件性基因prdm1敲除小鼠,选择B6.prdm1flox/wild.Lck-Cre、B6.prdm1flox/flox、B6小鼠作为对照,应用磁珠分选脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞,并应用Western blot方法检测Blimp-1目的蛋白。结果表明,2种转基因纯合子小鼠均有繁殖能力,其子代相互繁殖后第2代小鼠分离比例基本符合孟德尔遗传规律,亦可以成功获得较多的prdm1基因敲除小鼠。结论:应用Cre-loxp系统可以成功地获得prdm1基因敲除的小鼠。     

靶向stathmin和mdr1基因逆转卵巢癌细胞 紫杉醇耐药的研究

 目的探讨以RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术靶向stathmin和mdr1基因逆转卵巢癌细胞紫 杉醇耐药的可行性。方法分别构建靶向stathmin和mdr1基因的质粒：pGU6-GFP-neo-STMN1和pGU6-GFP- neo-MDR1;将质粒转染到卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV3/TAX。 Real-time RT-PCR检测stathminm和mdr1 的mRNA变化;Western blot检测其蛋白表达变化;荧光显微镜检测细胞凋亡情况;CCK-8法分析细胞对紫 杉醇的敏感度。结果Real-time RT-PCR及Western blot显示pGU6-GFP-neo-MDR1质粒对mdr1基因, pGU6- GFP-STMN1-294shRNA质粒对stathmin基因在mRNA水平和蛋白水平均有明显抑制（P<0.05）, 荧光显微镜 下共转染组细胞凋亡增多,CCK-8示共转染组逆转紫杉醇耐药效果最明显。结论体外RNAi可有效沉默卵巢 癌紫杉醇耐药株SKOV3/TAX细胞内stathmin基因和mdr1基因,逆转其紫杉醇耐药。     

造血干细胞移植预处理因素对小鼠肝脏作用的研究

目的 探讨造血干细胞移植各种常用预处理因素对小鼠肝脏的损伤作用.方法 8～10周龄雌性BALB/c小鼠40只,随机分为正常对照组、非清髓全身照射组、清髓剂量全身照射组、白消安组和环磷酰胺组,每组8只.观察小鼠的一般情况,计数外周血白细胞,组织病理观察肝脏病理变化,透射电镜观察肝脏细胞以及血管内皮的超微结构变化.结果 移植预处理后各实验组白细胞减少(P<0.05),各预处理组肝脏组织光镜下有不同程度的病理改变,电镜下肝细胞和肝脏血管内皮细胞亦有不同程度的损害.结论 造血干细胞移植预处理中全身照射、白消安和环磷酰胺均可导致肝脏病变以及血管内皮损害,是发生肝静脉闭塞病的重要原因.