利用CRISPR/Cas9系统构建HepG2细胞THRAP3基因敲除细胞系

目的 使用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除人类肝癌细胞HepG2中的甲状腺激素受体相关蛋白3(THRAP3)基因,构建THRAP3基因敲除细胞系.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性靶向THRAP3基因第3个外显子相关序列的多条小向导RNA,通过T7核酸内切酶筛选出切割效率最高的载体,构建pSpCas9-THRAP3真核重组表达质粒.测序鉴定后,将重组质粒转染至HepG2细胞中,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选细胞株,挑取单克隆,再用PCR、测序等方法鉴定细胞基因型,免疫印迹方法鉴定细胞THRAP3敲除效果.使用高通量测序的方法进行基因表达分析.用流式细胞仪检测基因敲除对细胞周期的影响,CCK-8试剂盒检测细胞增殖.结果 成功构建pSpCas9-THRAP3真核重组表达质粒,筛选出特异性敲除THRAP3基因的细胞系,验证了THRAP3敲除对细胞周期以及细胞增殖的影响.结论 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建并获得了THRAP3基因敲除细胞系并初步探究了THRAP3基因功能.     

腹膜后胰周脓肿并十二指肠多发性内瘘及腰大肌脓肿一例

患者　男 ,6 8岁。间断性腹痛、恶心、呕吐 2月伴发热1月收住。患者于 2月前出现腹痛 ,唐都医院诊断为“急性胰腺炎” ,治疗后好转出院。出院后不明原因发热 1月入我院消化内科。入院后查 :体温 37.5℃ ,脉搏 12 5次 /min ,胸腹壁轻度凹陷性水仲 ,脐上可触及一个 12cm× 13cm之包块 ,质软 ,活动度差 ,移动性浊音阳性 ,双下肢高度凹陷性水肿至膝关节上 10cm。辅助检查 :血常规 :WBC7.1× 10 9/L ,Hb82 g/L ;尿常规 ,WBC ( ) ,PRO (+) ,KET ( ) ,PBG(+) ,BLD( ) ;肝功 :ALb2 7.7g/L。肾功、血尿淀粉酶均正常。胃镜 :十二指肠腔内见…     

秀丽隐杆线虫在固有免疫和病原菌致病机制研究领域的进展

脊椎动物抵抗微生物感染的免疫反应可归纳为两类:快速反应的固有免疫和延迟4～7 d的适应性免疫[1].前者在进化上相当保守,低等生物到高等生物都存在,涉及复杂的信号调控途径和效应因子.可以借助研究低等模式动物来了解高等动物免疫机制.果蝇、斑马鱼、线虫、阿米巴盘基网柄菌和植物等逐渐为免疫学研究者们认同,利用这些模式生物各自的不同优点研究整体水平到分子水平上的病原菌一宿主反应机制.     

丙型肝炎病毒河北定州株C33c基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

采用反转录ＰＣＲ方法从河北定州地区献血员血清中克隆了丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ，ＨＣＶ）的Ｃ３３ｃ抗原基因，序列分析结果表明，该株的Ｃ３３ｃ基因和中国泰安株的同源性为９１．０％，氨基酸序列同源性为９２．２％；与ＨＣＶ河北株的同源性分别为９１．３％和９６．２％；和日本ＪＫ１株的同源性分别为９１．６％和９４．８％。克隆的基因在大肠杆菌中得到表达和纯化，并可用作抗ＨＣＶＥＬＩＳＡ试剂的抗原组分     

26例肺部疾病患者合并蠊缨滴虫感染的诊断和治疗

对26例痰中检出蠊缨滴虫的患者进行诊断与治疗，探讨蠊缨滴虫的致病性特点。患者临床表现为咳嗽、胸闷气短及白色黏液丝样痰。实验室检查，痰涂片及支气管肺泡灌洗液镜检见活体蠊缨滴虫。影像学检查，双肺可见肺间质性改变及肺泡渗出，斑点状透光影及纤维条索影，肺门密度增高。甲硝唑抗虫治疗有效。     

核因子κB降低小鼠胚胎成纤维细胞中Lmp2基因转录

目的 研究在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中,核因子κB(NF-κB)对Lmp2基因转录的影响.方法 利用NF-κB荧光素酶报告基因检测MEF和c-abl/arg缺失株(DKO)中内源性NF-κB活性;构建包含Lmp2启动子序列和NF-κB结合序列突变体的荧光素酶报告基因,通过双荧光素酶报告系统,研究NF-κB对Lmp2启动子转录活性的调控,并应用定量PCR、Western印迹比较Lmp2基因在MEF和DKO细胞中表达水平.结果 DKO细胞中内源性NF-κB活性上调;DKO细胞中Lmp2基因启动子的转录活性发生下调,并且NF-κB结合序列突变后,其转录活性升高;定量PCR和Western印迹结果表明,DKO细胞中Lmp2基因mRNA和蛋白表达水平比较MEF细胞均发生下调.结论 MEF中内源性NF-κB可负调控Lmp2基因转录,并降低其蛋白表达水平.     

一种实现外源基因在大肠杆菌中高表达的新策略

外源基因的序列结构在很大程度上决定了ｍＲＮＡ的稳定性及翻译的效率,是影响外源基因在大肠杆菌中表达水平高低的重要因素。目前基于外源基因结构的优化以提高表达水平的研究主要涉及翻译起始区结构的优化和稀有密码子的替换,但如果导致低水平表达的序列结构在基因中的位置难以被确定,或者由复杂的序列结构引起时,还缺乏有效的解决方法。本研究根据外源基因序列结构是影响其在大肠杆菌表达的重要因素,提出了“外源基因全序列结构优化”这一新的实现外源基因在大肠杆菌中高效表达的策略,并以经证实在大肠杆菌中表达效率很低的ＨＩＶ－…     

AHSG对胰岛素刺激下的HL-7702细胞中FAS、SREBP-1基因表达的影响

目的研究纯化后的人胎球蛋白A(AHSG)对HL-7702细胞胰岛素信号通路下游基因FAS、SREBP-1表达的影响。方法通过硫酸铵沉淀、PEG沉淀、DEAE离子交换和鱼精蛋白(protamine)亲和层析方法纯化血浆中的AHSG蛋白;单用胰岛素或胰岛素与AHSG共同处理HL-7702细胞后,提取细胞的RNA并且逆转录成cDNA,通过实时PCR(real-time PCR)方法分析细胞中FAS、SREBP-1基因mRNA的含量。结果 100 nmol/L胰岛素在1、2、3、4、5、6 h都可刺激HL-7702细胞中FAS、SREBP-1的基因表达量增加;在胰岛素刺激HL-7702细胞5 h时,FAS、SREBP-1基因表达量随胰岛素浓度的增加而升高;当HL-7702细胞用20 nmol/L胰岛素与100、300和600μg/ml的AHSG蛋白分别共同处理时,AHSG能抑制FAS、SREBP-1基因的表达,并且在600μg/ml时抑制作用较强。结论胰岛素能刺激HL-7702细胞中FAS、SREBP-1基因表达量的增加,但AHSG蛋白抑制由胰岛素刺激引起的FAS、SREBP-1基因表达量的增加。     

新型抗EGFR人源化抗体基因的构建和表达

目的：构建并表达进一步人源化且效果显著增强的抗EGFR抗体。方法：通过计算机辅助设计的结果,合成新型抗EGFR抗体的轻链和重链可变区序列,拼接成完整的轻链和重链基因并克隆入pIRES双表达载体。瞬时转染293T细胞,用rProteinA亲和层析柱从细胞培养上清中纯化抗体,并进行SDS-PAGE和免疫印迹鉴定。采用Biacore3000技术检测抗体结合抗原的能力;细胞侵袭实验初步检测抗体的功能。结果：成功构建3种不同突变体表达载体C2、C3和C5,纯化的抗体在还原SDS-PAGE中表现为相对分子质量约为25×103和50×103两条带;免疫印迹分析表明,该人源化抗体可与羊抗人IgG特异性结合。Biacore3000实验结果表明,C3抗体与抗原具有良好亲和活性（亲和力为6.13×10-10mol/L）;细胞侵袭实验结果表明,C2和C3抗体对肿瘤细胞生长迁移均具有一定的抑制作用。结论：成功构建、表达了3种抗EGFR人源化抗体C2、C3和C5,其中C3具有良好的抗原结合能力和抑制肿瘤细胞生长迁移能力。     

应用双抗原夹心法检测抗—HCV抗体

建立检测抗－ＨＣＶ抗体的双抗原夹心酶联免疫吸附测定方法。用基因工程手段，在大肠杆菌中表达ＨＣＶ抗原表位与大肠杆菌噬菌体ＭＳ２ ＤＮＡ聚合酶的融合蛋白，纯化后作为包被抗原，可溶性表达的ＨＣＶ抗原表位和霍乱毒Ｂ亚基的融合蛋白经辣根过氧化物酶标记后作为酶结合物，建立双抗原夹心ＥＬＩＳＡ。