Plk1调节c-Abl表达机制的初步研究

目的 研究Polo样激酶1(Polo-like kinase1,Plk1)对非受体酪氨酸激酶(cellular-abelsongene,c-Abl)表达水平的调控及其作用机制.方法 在293T细胞中过表达带有不同标签的Plk1,研究随着外源Plk1表达量的增加,内源c-Abl表达是否变化.分别通过放线菌酮翻译抑制实验和荧光定量PCR实验,研究Plk1是通过影响c-Abl蛋白稳定性还是转录活性来调节其表达.结果 细胞内c-Abl的表达随着外源Plk1的表达量的增加而增加,Plk1不影响c-Abl蛋白稳定性,但可调节c-Abl转录水平.结论 Plk1可在转录水平调节c-Abl表达.     

AHSG对胰岛素刺激下的HL-7702细胞中FAS、SREBP-1基因表达的影响

目的研究纯化后的人胎球蛋白A（AHSG）对HL-7702细胞胰岛素信号通路下游基因FAS、SREBP-1表达的影响。方法通过硫酸铵沉淀、PEG沉淀、DEAE离子交换和鱼精蛋白（protamine）亲和层析方法纯化血浆中的AHSG蛋白;单用胰岛素或胰岛素与AHSG共同处理HL-7702细胞后,提取细胞的RNA并且逆转录成cDNA,通过实时PCR（real-time PCR）方法分析细胞中FAS、SREBP-1基因mRNA的含量。结果 100 nmol/L胰岛素在1、2、3、4、5、6 h都可刺激HL-7702细胞中FAS、SREBP-1的基因表达量增加;在胰岛素刺激HL-7702细胞5 h时,FAS、SREBP-1基因表达量随胰岛素浓度的增加而升高;当HL-7702细胞用20 nmol/L胰岛素与100、300和600μg/ml的AHSG蛋白分别共同处理时,AHSG能抑制FAS、SREBP-1基因的表达,并且在600μg/ml时抑制作用较强。结论胰岛素能刺激HL-7702细胞中FAS、SREBP-1基因表达量的增加,但AHSG蛋白抑制由胰岛素刺激引起的FAS、SREBP-1基因表达量的增加。     

热休克蛋白65增强小鼠对HBV DNA 疫苗免疫反应的研究

目的:观察热休克蛋白65的真核表达载体(pHSP65)对HBV DNA疫苗诱导BALB/c小鼠(H-2d)免疫应答的调节作用。方法:肌内注射空载体pcDNA3,HBV DNA疫苗加HSP65佐剂(pHBVS2S pHSP65)或不加佐剂(pHBVS2S);ELISA法测定血清抗HBs抗体;ELISPOT检测分泌IFN-γ的脾淋巴细胞;4 h51Cr释放法检测小鼠脾细胞CTLs活性。结果:HBV DNA佐剂组免疫小鼠抗HBsAg抗体滴度虽高于不加佐剂组,但无显著性差异;其IgG1/IgG2 a的比例不同于多肽免疫组,二者分别为0.395与10。佐剂组小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴细胞量是不加佐剂组的2~3倍。CTLs细胞杀伤活性(E∶T=100)佐剂组与不加佐剂组分别为:(53.68±7.5)%、(42.81±7.7)%,差异显著(P<0.05)。结论:HBV DNA疫苗具有较强的免疫原性,能够诱导机体产生特异性的抗体及CTLs反应;HSP65佐剂能够有效提高小鼠对DNA疫苗的细胞免疫应答,有望成为DNA疫苗的免疫佐剂。     

利用CRISPR/Cas9系统构建HeLa细胞Cdc25C基因敲除稳定细胞株

目的 使用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除人类宫颈癌细胞HeLa中的细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cell division cycle 25 homolog C,Cdc25C)基因,构建Cdc25C基因稳定敲除细胞株.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计特异性识别Cdc25C基因第一外显子相关序列的上下游小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),构建真核重组表达质粒.测序鉴定后,将重组质粒转染至HeLa细胞中,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选稳定敲除Cdc25C基因细胞株,再用免疫印迹方法鉴定细胞Cdc25C敲除效果.最后用流式细胞仪检测基因敲除对细胞周期的影响.结果 筛选出稳定敲除Cdc25C基因细胞株,且Cdc25C敲除显著影响G2/M期进程.结论 利用CRISPR/Cas9技术成功获得了内源Cdc25C基因敲除细胞株,为研究Cdc25C在细胞周期进程的功能以及相关癌症的发生奠定了基础.     

胎球蛋白A的纯化及其对3T3-L1脂肪细胞胰岛素通路的抑制作用

目的 对胎球蛋白A(AHSG)蛋白进行纯化,并探讨其对脂肪细胞胰岛素通路的调节作用.方法 通过硫酸铵沉淀、PEG沉淀、DEAE离子交换和Protamine亲和层析方法纯化血浆中的AHSG蛋白.培养3T3-L1前脂肪细胞并分化为成熟脂肪细胞,置于低糖DMEM培养基培养,然后加入终浓度为100μg/ml和600μg/ml的AHSG及终浓度为600μg/ml的人白蛋白(HAS)分别进行培养,最后用不同浓度(0、10、20nmol/L)的胰岛素刺激细胞.采用Western blotting检测AHSG和HSA对3T3-L1脂肪细胞胰岛素下游分子IRS-1和Akt的磷酸化水平的影响.结果 从血浆中纯化的AHSG蛋白纯度达90%以上.纯化的AHSG在100μg/ml浓度下可以减弱胰岛素对IRS-1蛋白磷酸化的影响,在600μg/ml浓度下可以完全抑制IRS-1蛋白磷酸化;纯化的AHSG在100μg/ml浓度下可以减弱胰岛素对Akt蛋白磷酸化的影响,在600μg/ml的浓度下可以明显抑制Akt蛋白的磷酸化,而600μg/ml的HAS则不能抑制IRS-1和Akt蛋白的磷酸化.结论 从血清中纯化出的AHSG在生理浓度下可以抑制胰岛素对3T3-L1细胞中IRS-1和Akt蛋白的磷酸化作用,在脂肪细胞胰岛素通路中扮演着重要角色.     

bldD基因过量表达对红色糖多孢菌红霉素产量及孢子形成的影响

目的通过增加红色糖多孢菌调控基因bldD拷贝,获得红霉素高产菌株,并探讨bldD基因过量表达对红色糖多孢菌形态分化的影响。方法以红色糖多孢菌A226为出发菌株,通过染色体同源重组方法获得红色糖多孢菌A226bldD基因失活突变菌株A226-△bldD。将bldD基因表达质粒pZMW-bldD分别导入突变株A226-△bldD及出发菌株A226中,获得A226-△bldD/bldD菌株和A226/bldD菌株,利用TLC法和HPLC法对其发酵产物进行分析,并观察孢子生长状况。结果红色糖多孢菌A226中bldD基因失活后产红霉素水平明显降低,不能形成孢子;bldD基因的回复表达使A226-△bldD突变菌株产红霉素能力得到恢复,且孢子形成恢复正常;在红色糖多孢菌A226中过量表达bldD基因可提高红霉素产量,较出发菌株A226提高20%,同时可使孢子形成时间提前。结论在红色糖多孢菌中过量表达bldD基因,可获得红霉素高产菌株,同时会影响红色糖多孢菌形态分化进程。     

自拟平疣擦剂治疗扁平疣、传染性软疣、尖锐湿疣90例

目的 :观察自拟平疣擦剂治疗扁平疣、传染性软庞、尖锐湿疣的疗效。方法 :用无菌棉球将药液涂于患处 ,每日 2～ 4次 ,1周为 1疗程。结果 :总有效率为 10 0 %。结论 :该疗法可清热解毒 ,平疣止痒 ,且简便易行 ,疗程短 ,疗效高     

不同地区人群SARS血清流行病学调查

目的分析严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)流行期间不同地区人群及SARS临床诊断病例血清特异性抗体(SARS-CoV IgG)变化规律以及健康人群是否存在隐性感染。方法采用酶联免疫方法(ELISA)及间接免疫荧光法(IFA)，对香港、澳门、北京、广州地区1453名健康人及广州和北京地区257例SARS临床诊断病例进行血清SARS—CoV IgG抗体检测，并跟踪检测患者病后不同时间(发病3～270d)血清抗体变化情况。结果4个地区健康人群(包括160名密切接触者)中，用ELISA法检出2例SARS—CoV IgG抗体阳性，阳性者进一步用IFA检测则为阴性；广州地区200名健康体检者同时采用ELISA和IFA检测，结果均为阴性。ELISA和IFA同时检测257例临床诊断病例发病20d后的血清SARS—CoV IgG抗体，2种方法检出的阳性率均为90％。ELISA法跟踪检测257例临床诊断病例发病后3～270d血清IgG抗体，抗体滴度在发病后4～6个月内随时间延长逐渐升高，多数病人抗体在第4～6个月达到高峰，并持续到第8个月，部分病人抗体达高峰后开始下降，但至第9个月仍阳性。结论健康人群中隐性感染率极低，血清SARS—CoV IgG抗体在病程后期有诊断价值，血清特异性抗体可持续9个月以上。