SNP基因芯片结合多重置换扩增技术检测单细胞 非整倍体的研究

 【目的】 建立并优化利用微阵列-比较基因组杂交技术检测单细胞非整倍体的实验方案&#65377; 【方法】 纤维母细胞系GM02732(47, XY, +18)和GM00343[46, XY, 4(del) (qter > p14)]被用于实验&#65377;阳性对照组为上述细胞系的基因组DNA(gDNA)(A组与B组,n = 6);实验组为单细胞模板的多重置换扩增(MDA)产物(C组与D组,n = 10);阴性对照组为空白对照的MDA产物(E组,n = 6)&#65377;以上样本与10 k 2.0基因分型芯片杂交并进行染色体拷贝数分析,比较利用非扩增的正常gDNA和同法扩增的DNA(MDA-DNA)作为分析参照对C组和D组的结果准确度的影响&#65377;【结果】 A→E组的芯片杂交信号判读率分别为98.7%&#65380;97.2%&#65380;86.7%&#65380;85.9%与3.2%&#65377;利用单细胞MDA-DNA作为参照时,C组与D组杂交信号的变异程度明显小于使用gDNA作为参照时(P < 0.05)&#65377;利用CNAT分析软件,发现以gDNA作为参照时,C组与D组部分染色体优势扩增明显,而使用MDA-DNA作为参照时则未观察到类似现象&#65377; 【结论】 结合MDA和基因芯片平台对单细胞进行非整倍体检测时应使用同法扩增的DNA作为分析参照&#65377;     

应用钙离子载体A23187及6-甲基嘌呤对人卵母细胞进行孤雌激活

目的 :观察钙离子载体 A2 3 1 87( Ca-A2 3 1 87)及 6-甲基嘌呤 ( 6-DMAP)对人类卵母细胞的孤雌激活作用。方法 :收集体外受精周期中不适于进行卵胞浆内单精子注射的生发泡期或第一次减数分裂中期的不成熟卵母细胞 2 44个在体外培养成熟 ,其中 1 55个体外成熟卵母细胞按不同激活方案分组 :5μmol/ L Ca-A2 3 1 87组、1 0 μmol/ L Ca-A2 3 1 87组、对照组、6-DMAP组及 Ca-A2 3 1 87+6-DMAP组。激活处理后 1 2～ 1 8h观察第二极体排出及原核形成情况。结果 :5及 1 0 μmol/ L Ca-A2 3 1 87组卵母细胞激活率分别为 40 .7% ( 1 1 / 2 7)和 3 7.1 % ( 1 3 / 3 5) ,较对照组的 9.5% ( 2 / 2 1 )明显增加 ( P<0 .0 1 ) ;6-DMAP组的激活率 ,1 1 .5% ( 3 / 2 6)较 Ca-A2 3 1 87+6-DMAP组 ,58.7% ( 2 7/ 46)明显下降。 Ca-A2 3 1 87激活后卵母细胞主要表现为一原核二极体 ,而 Ca-A2 3 1 87+6-DMAP激活的卵母细胞以一原核一极体占多数 ( 1 9/ 2 7,70 .4% )。结论 :卵母细胞孤雌激活的发生及原核形成类型与激活方案有关 ,单独 Ca-A2 3 1 87或与蛋白激酶抑制剂 6-DMAP联合应用都能使人类卵母细胞发生孤雌激活 ,二者联合应用更易于诱导卵母细胞发生孤雌激活     

卵子第一极体形态与胚胎形态和临床妊娠关系分析

目的 了解卵子第一极体形态与胚胎形态和临床妊娠的关系。方法 对因男性不能的91例患进行单精子卵胞浆内注射（ICSI）治疗91个周期，进行ICSI操作时对卵子第一极极形态评定，胚胎移植当天对胚胎形态进行评定，胚胎移植后确定临床妊娠，分析卵子极体形态与胚胎形态和临床妊娠之间的关系。结果 随着极体形态不规则化，取卵后第3天胚胎发育≥6个细胞的胚胎比例和碎片（20％的胚胎比例呈下降趋势；使用射出精进行单精子细胞浆内注射的74例患妊娠中移植的1级和2级极体胚胎总比例显高于非妊娠组（P＜0．05），且在＜35岁患组中随移植胚胎中1、2级极体胚胎数目的增多，临床妊娠率和多胎妊娠率高。在使用附睾清和睾丸精患中，妊娠组称移植的1级和2级极体胚胎比例高于非妊娠组，但不具统计学差异。结论 对卵子极体评定有助于选择质量的胚胎进行移植。     

少量细胞模板下多重置换扩增技术的保真度评估

目的 应用单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片,检测以少量细胞(1～10个)为模板的多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)产物的保真度.方法 结合10K 2.0 SNP芯片平台与MDA,以纤维母细胞系GM02732(47,XY,+18)作为模板,共分6组进行实验,其中A组与B组分别为阳性对照组(细胞gDNA)与阴性对照组(无模板MDA);C～F组为实验组,分别以1、2、5和10个细胞为模板进行MDA扩增,产物与芯片杂交,检测并比较各组产物的基因组覆盖率、等位基因杂合性缺失(loss of heterozygosity,LOH)率以及等位基因脱扣(allele dropout,ADO)率.结果 阴性对照组的MDA产物与gDNA序列有3.2%的重叠.随着起始模板从单细胞提升至10细胞,MDA产物的基因组覆盖率从86.4%逐步上升至96.4%,平均LOH率和ADO率则逐渐下降,各组之间比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 多重置换扩增技术是一种高效而可靠的全基因组扩增方法 ,随着模板细胞的增加,MDA产物的保真度可获得明显的改善.10K 2.0 SNP芯片可快速准确地在全基因组水平对DNA扩增产物进行保真度分析,但应注意区分LOH中的ADO和等位基因优势扩增,以避免产生误差.     

卵裂期评分对优质囊胚移植妊娠结局的预测价值探讨

目的:探讨优质囊胚的卵裂期胚胎评分对囊胚移植妊娠结局的预测作用。方法:回顾性分析2012年10月至2015年10月于中山大学附属第六医院生殖医学研究中心行新鲜或解冻优质囊胚移植的108例周期资料,其中移植来源于优质卵裂期胚胎的优质囊胚为H-H组(59例),移植来源于非优质卵裂期胚胎的优质囊胚为P-H组(49例)。比较两组移植情况及妊娠结局,并采用Logistic回归分析临床妊娠结局的相关因素。结果:H-H组59例均为单囊胚移植;P-H组中有42例为单囊胚移植;7例移植2枚囊胚(1枚优质囊胚及1枚非优质囊胚);H-H组的临床妊娠率及胚胎种植率较P-H组高(57.63%vs 34.69%,P=0.017;57.63%vs 32.14%,P=0.004),且流产率较后者低(16.13%vs 47.06%,P=0.039)。Logistic回归分析提示优质囊胚的卵裂期评分与临床妊娠结局相关(OR 2.560,P=0.019),而其他混杂因素与临床妊娠结局的关联差异无统计学意义(P0.05)。结论:卵裂期评分较低的胚胎,即使发育至优质囊胚,移植后妊娠率和流产率并不乐观,或不适用于优质单囊胚移植策略。优质囊胚的卵裂期评分可作为胚胎发育潜能的预测因素,改进优质单囊胚移植策略的实际应用。     

ＧＤＦ９和ＢＭＰ１５在未刺激多囊卵巢综合征卵巢组织中的异常表达

摘要：【目的】检测未经过促排卵刺激的ＰＣＯＳ患者和正常排卵妇女卵巢组织中ＧＤＦ９和ＢＭＰ１５的蛋白表达水平以及比较两组之间的表达差异。【方法】收集未经过卵巢刺激的ＰＣＯＳ患者（ＰＣＯＳ组）和正常排卵妇女（对照组）的卵巢组织,采用免疫组织化学染色的方法检测卵母细胞和颗粒细胞中ＧＤＦ９和ＢＭＰ１５的蛋白表达水平。【结果】ＧＤＦ９和ＢＭＰ１５蛋白在未刺激卵母细胞和颗粒细胞中均有表达,并且呈现阶段依赖性。ＧＤＦ９蛋白在ＰＣＯＳ早期卵泡卵母细胞和颗粒细胞中的表达水平均低于对照组并且表达滞后（Ｐ＜０．０５）,ＢＭＰ１５蛋白在ＰＣＯＳ早期卵泡的颗粒细胞中也存在表达水平降低和滞后现象（Ｐ＜０．０５）,但是在ＰＣＯＳ卵母细胞中的表达与对照组没有差异（Ｐ＞０．０５）。【结论】ＧＤＦ９和ＢＭＰ１５蛋白在未刺激卵母细胞和颗粒细胞中均呈现阶段依赖性表达;两种因子在ＰＣＯＳ早期卵泡阶段存在表达水平降低并且滞后现象,提示可能与ＰＣＯＳ卵泡发育紊乱有关。     

胚胎实验室质量控制

胚胎实验室质量控制是辅助生殖技术中重要的一环。通过质量控制,生殖中心的胚胎实验室培养体系得以保持稳定的状态。这对于维持生殖中心良好的妊娠率具有至关重要的作用。良好的质量控制包括胚胎实验室仪器设备、培养液耗材、人员质控以及定期质控自查。本文将结合本中心实际情况分别对这四方面进行论述。     

卯母细胞滑面内质网聚集的研究进展

在人类辅助生殖中,经促排卵体外获得的卵母细胞中,有滑面内质网聚集(smooth endoplasmic reticulum aggregate,SERa)形成者占有一定比例.既往研究显示,SERa对胚胎质量及妊娠结局会造成不良影响.但近年来研究显示:SERa卵母细胞可诞生完全健康的新生儿.卵母细胞胞质内SERa的形成可能与遗传因素、卵巢过度刺激、超促排卵方案及扳机日高雌二醇(E2)等多种因素相关.大多数学者认为卵母细胞SERa的形成会导致受精率、卵裂率和囊胚形成率降低及胚胎质量的下降,使得妊娠率显著降低;然而,也有多项报道已证实SERa的卵母细胞的胚胎质量与正常卵母细胞并无差异.因此对于那些临床助孕治疗中获得SERa胚胎或者胚胎数目不足的患者,可考虑移植SERa胚胎.未来,应多关注SERa对体外受精(IVF)结局的影响及着重阐明SERa形成机制,从而从根本上防止异常卵母细胞的出现.     

体外受精-胚胎移植治疗中卵巢反应性的影响因素分析

【目的】探讨体外受精．胚胎移植（IVF-ET）过程中卵巢对控制性促排卵（COS）反应性的影响因素．寻找合适的预测卵巢反应性的指标。【方法】回顾性分析在中山大学附属第一医院生殖医学中心接受IVF-ET的1342名不孕病人IVF-ET第1治疗周期的资料。【结果】采用单因素线性回归分析：女性年龄、基础血清FSH、E2水平、基础血清FSH／LH比值与控制性促排卵的获卵数呈负相关（P〈0．01），而月经周期天数、基础血清LH水平与控制性促排卵的获卵数呈正相关（P〈0．01）。经多因素线性回归分析：女性年龄、基础血清FSH、E2水平、基础血清FSH／LH比值与控制性促排卵的获卵数呈负相关（P〈0．01），而月经周期天数与控制性促排卵的获卵数呈正相关（P〈0．01）。【结论】女性年龄、月经周期天数、基础血清FSH、E2水平、基础血清FSH／LH比值可以预测控制性促排卵的卵巢反应性。     

慢速程序冷冻对透明带显微操作后人类胚胎冻存率及发育的影响

[目的]探讨慢速程序冷冻对透明带显微操作后胚胎冻存率及继续发育的影响.[方法]将96个Ⅱ级以上人类多精受精胚胎随机分为单纯透明带打孔组(n=24),胚胎活检组(n=40)及对照组(n=32).为模拟临床种植前诊断活检后胚胎冷冻过程,将透明带显微操作后胚胎继续培养6～10 h再进行慢速程序冷冻,观察各组胚胎冷冻解冻后的冻存率及胚胎继续发育能力.[结果]活检及透明带打孔后冻融胚胎中发生裂解的卵裂球多位于透明带破口附近.活检组胚胎完整率、胚胎存活率及卵裂球存活率分别为10%,25.0%和29.0%,较对照组(43.7%,66.0%和62.4%)明显降低(P<0.01).虽然单纯透明带打孔组冷冻后胚胎完整率及胚胎存活率与活检组无明显差异,但卵裂球存活率较胚胎活检组高(分别为40.9%和29.0%)(P<0.01),以上各组存活胚胎继续发育率差异无显著性(P>0.05).[结论]以丙二醇和蔗糖为冷冻保护剂的人类分裂期胚胎慢速冷冻程序并不适用于化学法透明带打孔活检胚胎的冷冻保存,有关人类活检后胚胎的冷冻保存方法值得进一步探讨.