原发性胆汁性肝硬化患者外周血单个核细胞中糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体mRNA表达水平的研究

目的 探讨原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者外周血单个核细胞(PBMCs)中肿瘤坏死因子受体(GITR)mRNA表达及其与疾病发病机制、疾病活动性的关系.方法 采用反转录实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)的方法 ,在Light Cycler Real time PCR检测仪上检测78例PBC患者(活动期44例、缓解期34例)、肝癌患者30例(疾病对照组)、健康体检者30名(健康对照组)PBMCs中GITR mRNA的表达水平和含量.以△Ct=Ct(待测基因)-Ct(内参基因)来比较基因表达水平的高低.结果 活动期PBC患者GITR mRNA表达水平(△Ct=10.5±2.8)明显低于缓解期PBC患者(△Ct=7.2±2.3,P<0.01);活动期PBC患者GITR mRNA表达水平(△Ct=10.5±2.8)明显低于健康对照组(△Ct=7.4±1.1)与肝癌组(△Ct=5.9±1.3,P<0.01);缓解期PBC患者GITR mRNA表达水平与健康对照组差异无统计学意义(P>0.05);肝癌患者GITRmRNA表达水平明显高于健康对照组及PBC患者(P<0.01).结论 GITR的表达与PBC的发生发展存在定关联性,可能参与了PBC的发病过程并与疾病的活动性有关.     

去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位基因片段的克隆表达及其检测自身免疫性肝炎的价值

Objective To clone and express the human asialoglycoprotein receptor(ASGPR) H1 subunit, purify and identify the immunoreactivity of the recombinant protein, and establish the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) to detect anti-ASGPR antibodies in diagnosis of autoimmune hepatitis. Methods The CRDHI cDNA (435 bp) was subcloned into eukaryotic vector PEGH, and the recombinant protein expression was induced by D (+)-Galactose. The recombinant CRDH1 was purified with Glutathione Sepharose 4B, and its immunoreactivity was identified by SDS-PAGE and western blot as well as MALDI-TOF. ELISA was established to detect the anti-ASGPR antibodies in serum samples of 45 patients with AIH, 30 patients with SLE, 30 patients with RA, 10 patients with SS and 30 normal controls. Results The sequencing of recombinant plasmid showed the CRDH1 gene was successfully inserted to the eukaryotic expression vector with correct sequence and open reading frame. The fusion protein showed a molecular weight of 42 500 Da on SDS-PAGE gel and confirmed to be the human ASGPR by MALDI-MS through peptide mass fingerprint analysis with Mascot in human protein database. It shared 98. 34% homology with ASGPR H1 subunit. Western blot analysis showed that the fusion protein had the same immunoreactivity as human ASGPR. The results of ELISA indicated that the positive rate of anti-ASGPR was 35.6% ( 16/45 ), but the ELISA was negative in other control. There was significant difference of positivity of the autoantibodies between AIH and non-AIH controls (χ2 = 31.85,P < 0. 01 ). Conclusions The human plasmid containing ASGPR is successfully clone into Saccharomyces cerevisiae Y258. The recombinant autoantigen owns good antigenicity and specificity. ELISA established with the purified protein shows good specificity for diagnosis of AIH.     

组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原的原核表达及初步临床应用

目的 通过克隆人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,构建重组表达质粒,获得具有免疫活性的纯化重组蛋白,建立间接ELISA法,并探讨其在检测多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)中的抗Jo-1抗体的价值.方法 构建重组表达载体,在大肠杆菌DH5 α和BL21(DE3)中表达;融合蛋白经Ni-NTA树脂柱进行亲和层析纯化,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(WB)进行免疫活性鉴定;应用表达蛋白建立间接ELISA法.同时用该方法检测30名正常献血者,30例SLE,30例类风湿关节炎(RA),10例原发性干燥综合征(SS),75例PM/DM患者血清中抗Jo-1抗体.结果 经重组质粒测序和酶切结果证实,Jo-1目的基因已正确插入原核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;经SDS-PAGE检测显示,表达产物在相对分子质量55 000处有一明显的蛋白表达条带;WB分析表明,重组蛋白具有人Jo-1抗原反应性;间接ELISA法检测标本血清结果显示,PM/DM组中抗Jo-1抗体的阳性率为28%,非PM/DM组(疾病对照组及正常对照组)均为阴性,其差异均有统计学意义(x2=31.84,均P＜0.01).结论 成功克隆了人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,其可在大肠杆菌中表达,且重组自身抗原具有较好的抗原性和特异性.应用纯化融合蛋白建立的间接ELISA法检测PM/DM抗Jo-1抗体具有较好的特异性.     

抗线粒体抗体阳性患者的AMA-M2亚型检测及ANA核型分析

目的了解不同滴度抗线粒体抗体(AMA)阳性患者AMA M2亚型抗体(AMA-M2)浓度分布状况及在原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者中的阳性率及相伴ANA核型。方法采用间接免疫荧光法检测自身抗体,采用酶联免疫吸附试验检测502例AMA阳性标本中的AMA-M2,并对已明确诊断的71例PBC患者进行AMA-M2亚型及ANA核型分析。结果在502例AMA阳性患者中AMA-M2阳性率为76.1%;71例PBC中95.8%AMA抗体效价大于1:160、90.1%AMA抗体效价大于1:320、73.2%AMA抗体效价大于1:640。95.8%AMA-M2阳性:67.6%M2200 RU/ML、84.5%M2100 RU/ML,并有56.3%存在ANA。结论 PBC中AMA、AMA-M2呈高滴度、高浓度集中,高效价AMA、AMA-M2及ANA的部分核型有助于PBC的诊断。     

临床标本抗核抗体102 651例检测结果回顾性分析

目的 探讨抗核抗体(ANA)在临床就诊患者中的阳性分布趋势及在自身免疫病(AID)中的临床意义.方法 采用间接免疫荧光法(IIF)检测102 651份来自2004年至2008年期间北京协和医院就诊患者血清标本中的ANA(男女比例1:3,平均年龄41岁).选取符合AID诊断的患者3 064例,其中:SLE 1 757例、干燥综合征(SS)250例、类风湿关节炎(RA)518例、多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)150例、系统件硬化症(SSc)171例、原发性胆汁性肝硬化(PBC)108例、自身免疫性肝炎(AIH)44例及强直性脊柱炎(AS)66例.疾病对照组 560例,其中:炎症性疾病452例和肿瘤108例.分析ANA在不同性别、年龄(≤20岁组、21～49岁组、≥50岁组)和AID患者中的阳性率、滴度以及荧光模式的分布.结果 在102 651份检测标本中,ANA阳性率为49%,其中男性为26%,女性为56%,二者差异有统计学意义(χ~2=6 652.84,P<0.01).不同年龄组间ANA阳性患者的阳性率差异也有统计学意义(≤20岁组46%、21～49岁组50%、≥50岁组47%,χ~2:108.68,P<0.01).ANA 阳生患者荧光模式分析表明,单一荧光模式以斑点型(34%)和均质型(16%)为主,混合荧光模式以斑点/均质型为主(16%).而AID组中的SLE、SS、RA、PM/DM患者单一荧光模式以斑点型为主(分别为32%、40%、28%、31%),PBC患者以核膜型、着丝点型为主(分别为36%、14%).AID患者的ANA阳性率为82%,与疾病对照组(13%)比较,差异有统计学意义(χ~2=1 114.15,P<0.01).其中SLE的阳性率最高为94%.AID患者滴度以≥1:160为主,疾病对照组患者以1:80滴度为主.结论 临床就诊患者中ANA的阳性率在不同性别、年龄组间存在差异;不同AID患者中的ANA阳性率和滴度均存在差异,临床检验工作中应重视ANA滴度在AID诊断中的临床价值.另外,ANA阳性患者的荧光模式旱现多样性,特别是某些特殊荧光模式对AID的诊断具有重要临床意义,但仅根据荧光模式来判断AID则有一定的片面性.`     

抗核抗体筛查试验与特异性抗体确认试验的相关性研究

目的 分析探讨抗核抗体(ANA)筛查试验与特异性抗体确认试验的相关性.方法 用间接免疫荧光法(IIF)作为ANA筛查试验,用免疫印迹法(LIA)作为抗核抗体谱(ANAs)特异性抗体确认试验,对500份临床就诊患者血清标本进行检测分析,并根据IIF-ANA和LIA-ANAs检测结果分为4组(IIF-ANA~+/LIA-ANAs~+组、IIF-ANA~+/LiA-ANAs~-组、IIF-ANA~-/LIA-ANAs~+组、IIF-ANA~-/LIA-ANAs~-组).同时收集IIF-ANA~-/LIA.ANAs~+组标本,使用ELISA、双向免疫扩散法(DID)进行特异性抗体复查.结果 500份患者的标本中IIF-ANA~+/LIA-ANAs~+组为247份,IIF-ANA~+/LIA-ANAs~-组为86份,IIF-ANA~-/LIA-ANAs~-组为152份,IIF-ANA~-/LIA-ANAs~+组为15份.IIF-ANA~+/LIA-ANAs~+组中IIF-ANA滴度以≥1:1 280为主,占48.2%,1:80-1:160占23.9%,1:320-1:640占27.9%.在167例IIF.ANA~-患者中LIA-ANAs~+占9.0%(15/167),15份IIF-ANA~-/LIA-ANAs~+标本中:包括11份抗SSA抗体和抗R052抗体阳性,并与ELISA、DID法复查结果基本一致;抗组蛋白(Histone)、抗Scl-70、抗Jo-1、抗线粒体-M2(AMA-M2)抗体阳性各1份.LIA-ANAs与ELlSA、DID的阳性符合率为100%、69%.且IIF-ANA~-/LIA-ANAs~+组患者经临床资料分析明确诊断自身免疫病(AID)者为8例.86份为IIF.ANA~+/IJA.ANAs~-的标本,以1:80～1:160的滴度为主(50.0%),荧光模式以均质型(H)为主(36.1%),其与IIF-ANA~+/LIA-ANAs~+组比较[1:80～1:160的滴度占23.9%,荧光模式均质型(H)占17.0%],差异有统计学意义(χ~2=20.47、12.42,P均<0.05).结论 ANA临床检测中町先以筛查试验进行检测,若阳性,再进行特异性抗体确认试验.但足,对于临床疑似AID的患者,无论ANA初筛试验阴性与否,均需进行各种针对特异性抗体的确认试验;各种特异性抗体的确认试验不能完全替代ANA的筛查试验.     

原发性胆汁性肝硬化患者抗线粒体抗体亚型检测的临床意义

为探讨原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者血清抗线粒体抗体(AMA)亚型抗M2、M4、M9抗体的临床意义,采用间接免疫荧光法检测96例PBC患者血清AMA水平,采用酶免疫斑点法检测AMA-M2、M4、M9抗体水平,应用全自动生化分析仪检测ALT等生化指标。结果表明96例PBC患者中,荧光法AMA阳性率为84.4%,抗M2抗体为81.3%;斑点法抗M2抗体阳性率为72.9%,抗M4抗体为44.8%,抗M9抗体为18.8%,抗M2和M4抗体同时阳性阳性率为43.8%,抗M2和M9抗体同时阳性阳性率为16.7%,抗M2、M4和M9抗体同时阳性阳性率为13.5%,抗M4抗体阳性的PBC患者ALT、AST和IgM水平明显高于抗M4抗体阴性(P<0.05),抗M9抗体阳性的PBC患者ALT、AST和IgG水平明显低于抗M9抗体阴性(P<0.05)。AMA-M2抗体的检测对PBC患者有诊断意义,抗M4抗体和抗M9抗体的检测对于PBC患者的病情判断有意义。     

系统性红斑狼疮患者血清脱氧核糖核酸酶活性检测的临床意义

检测系统性红斑狼疮(SLE)患者血清脱氧核糖核酸酶(DNase)的活性,探讨其在判断SLE疾病活动及狼疮肾炎(LN)中的临床意义.采集116例SLE患者、30例疾病对照者和30名健康体检者(对照组)的血清,用ELISA法定量检测血清DNase活性.结果表明:SLE患者血清DNase活性明显低于疾病对照组和健康对照组(P<0.01),且疾病活动期低于缓解期(P<0.01);DNase活性与SLE疾病活动程度呈负相关(P<0.01);狼疮肾炎组DNase活性低于SLE非狼疮肾炎组,两组比较有统计学意义(P<0.05).DNase活性下降可能是促进SLE及LN发生、发展的重要因素之一.血清DNase活性检测可用于判断SLE及其疾病活动程度的指标之一,同时也可作为判断LN的危险因素之一.     

自身抗体联合检测对系统性红斑狼疮诊断的意义

为了评价抗核小体抗体(anti-nucleosome antibody,AnuA)、抗Sm抗体、抗双链DNA(double stranded-DNA,dsDNA)抗体、抗核糖体P蛋白(ribosomal P protein,rRNP)抗体联合检测对系统性红斑狼疮(SLE)诊断的价值,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定123例SLE患者、61例其他结缔组织病患者和30名健康对照者血清中An.uA、抗dsDNA抗体、抗Sm抗体、抗rRNP抗体含量.结果显示,AnuA、抗dsDNA抗体、抗Sm抗体和抗rRNP抗体在SLE患者中的阳性率明显高于疾病对照组和正常对照组;AnuA与抗dsDNA抗体的敏感性显著高于其他两种自身抗体;抗dsDNA抗体、抗sm抗体和抗rRNP抗体阴性的SLE患者中,AnuA阳性率为52.6%～68.0%;SLE活动期患者与非活动期患者AnuA、抗dsDNA抗体阳性率有显著性差别.四种自身抗体在SLE的诊断中有明显的互补作用,特别是AnuA和抗dsDNA抗体可以弥补其他抗体的不足;AnuA、抗dsDNA抗体与疾病活动性密切相关.AnuA与抗sm抗体或AnuA与抗dsDNA抗体的二联检测可明显提高其对SLE诊断的敏感性.AnuA、抗dsDNA抗体、抗Sm抗体三联检测的阳性率可达87%.自身抗体联合检测提高了诊断的敏感性,对SLE的诊断和治疗有重要意义.     

血清ANCA和GAB不同类型抗体检测在溃疡性结肠炎中的临床应用

目的:探讨血清中抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)和抗小肠杯状细胞抗体(GAB)lgA、lgG对溃疡性结肠炎(UC)诊断的临床价值。方法:收集2018年4月到2019年4月在北京协和医院门诊或住院就诊的患者为研究对象,分为UC组93人,其他肠道疾病患者组93人,分别用间接免疫荧光法检测两组患者的ANCA-IgA、ANCA-IgG、GAB-IgA、GAB-IgG共4种自身抗体,对IgA、IgG的阳性率进行比较。结果:UC组ANCA-IgG、ANCA-IgA和GAB-IgG、GAB-IgA的阳性率分别为43.0%、26.8%、38.7%和5.3%,高于其他肠道疾病组的2.1%、0%、5.3%、0%,两组间ANCA-IgA、ANCA-IgG、GAB-IgG阳性率差异有统计学意义(P<0.05),GAB-IgA差异无统计学意义(P>0.05)。ANCA-IgA、GAB-IgA的特异性(100%、100%)高于ANCA-IgG、GAB-IgG(97.8%、94.6%),但敏感性(26.8%、5.3%)低于ANCA-IgG、GAB-IgG(43.0%、38.7%)。联合ANCA、GAB 4种抗体检测的阳性率为70.9%,但特异性为92.5%。结论:ANCA、GAB-IgA比IgG特异性好,IgG辅之IgA同时检测有助于提高UC的诊断水平,ANCA-IgA/IgG和GAB-IgA/IgG 4种抗体联合可提高UC的检出率,减少漏检率。