幽门螺杆菌中国分离株vacA基因多态性分析

目的 分析幽门螺杆菌(HP)中国菌株vacA基因多态性.方法 对分离自中国7个不同地区、不同胃十二指肠相关疾病患者的119株HP,采用特异引物聚合酶链反应(PER)方法,对其vacA基因进行PCR扩增.根据核酸电泳中产物片段大小确定vacA等位基因类型并统计分析各型分布.对vacA基因核心片段进行PCR扩增和DNA测序,利用软件MEGA4.0对DNA测序结果进行聚类分析.结果 119株HP的vacA基因以sla、m2和il型为主,分别为97.5%(116/119)、68.9%(82/119)和91.6%(109/119).26.1%(31/119)为mlb;slb,mla未检出.vacA组合基因型以sla/m2/il为主(62.2%,74/119),sla/mlb/il次之(25.2%,30/119).不同地区、不同疾病来源菌株sla分布的差异无统计学意义(P>005).而m区基因多态性在疾病类型及分离地区间差异有统计学意义(P<0.01).不同疾病来源菌株间i区基因分型分布的差异无统计学意义,但不同分离地区菌株间差异有统计学意义(P<0.01).119株的vacA基因序列聚类为三个不同组群.结论 HP中国分离株vacA基因型以sla/m2/il组合型为主,sla分型结果与菌株分离地区及疾病类型无关.不同地区、不同疾病来源菌株m区基因分型不同.不同地区菌株vacA基因i区分型不同,但i区基因分型与菌株的疾病来源无显著相关性.

Abstract：

Objective To understand the polymorphism of Helicobacter pylori (H. pylori) vacA alleles in China. Methods A total of 119 H. pylori strains were isolated from different gastroduodenal diseases in 7 different geographic regions in China. vacA and its alleles were identified according to the length of PCR products with DNA electrophoresis. The distributions of vacA alleles were statistically analyzed. The core fragment of vacA was sequentially analyzed by software MEGA4.0. Results The alleles in vacA dominantly belonged to sla, m2 and il in the tested strains.The distribution appeared to be 97.5%(116/119) ,68.9%(82/119) and 91.6%(109/119),respectively.The mlb allele appeared to be 26.1% (31/119). slb and mla were not found. The major vacA recombination was between slaim2/il and 62.2% , followed by sla/mlb/il (25.2% , 30/119). No association was found between the distribution of sla allele and the clinical outcome, as well as the geographical regions (P>0.05). However, the distribution of m alleles showed significant difference both among the types of disease and the geographic regions (P<0.01), The present of i alleles did not show significant differences among disease patterns, but had significant differences between different geographic groups (P<0.01). Three clusters were identified among these 119 isolates according to the DNA sequence of vacA. Conclusion sla/m2/il appeared to be the main allele in H. pylori vacA isolates from China in this study. The distribution of m alleles in vacA was correlated both to the regions and the disease patterns. The presence of i allele was associated to the regions but not the disease patterns.     

空肠弯曲菌喹诺酮类抗生素敏感性检测及其耐药机理分析

目的 了解我国不同宿主来源空肠弯曲菌对喹诺酮及氟喹诺酮类抗生素的耐药现状,分析耐药菌株的耐药机制。方法 利用96孔琼脂稀释法分析不同来源空肠弯曲菌对萘啶酸、环丙沙星两种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。对102株检测耐药的菌株和27株敏感菌株通过基因测序的方法分析其耐药机制。结果 234株空肠弯曲菌中共筛查到218株(93.16%)萘啶酸耐药菌株,其中鸡粪和鸭粪来源菌株耐药率均为100.00%,腹泻病人粪便来源菌株耐药率是97.96%,食品动物来源菌株耐药率是97.83%,牛粪来源菌株耐药率是77.97%,耐药率差异有统计学意义(P<0.05),鸡粪和鸭粪来源菌株耐药率最高;211株(90.17%)环丙沙星耐药菌株,其中鸡粪和鸭粪来源菌株耐药率均为100%,腹泻病人粪便来源菌株耐药率是91.84%,食品动物来源菌株耐药率是95.65%,牛粪来源菌株耐药率是77.97%,耐药率差异有统计学意义(P<0.05),鸡粪和鸭粪来源菌株耐药率最高。所有的耐药菌株gyrA基因的喹诺酮类耐药决定区(QRDR)都存在Thr-86-Ile点突变。gyrB基因相关区域测序显示不存在有意义突变。结论 我国分离空肠弯曲菌菌株对萘啶酸、环丙沙星耐药严重,gyrA基因QRDR内的Thr-86-Ile突变能引起空肠弯曲菌对喹诺酮类及氟喹诺酮类抗生素高水平耐药。     

空肠弯曲菌多重聚合酶链反应基因鉴定及其毒力相关基因分析

目的建立空肠弯曲菌、结肠弯曲菌多重聚合酶链反应（m-PCR）鉴定方法,并对菌株毒力相关基因cadF、virB11、flaA、cdtA、cdtB、cdtC的分布进行初步分析。方法利用m-PCR的方法对经过传统生物化学方法鉴定的65株弯曲菌进行鉴定,并通过空肠弯曲菌特异基因hipO、结肠弯曲菌glyA基因特异片段的PCR扩增对鉴定的结果进一步验证;利用特异引物PCR方法初步分析其毒力、毒素相关基因cadF、virB11、flaA、cdtA、cdtB和cdtC的分布。结果m-PCR扩增结果发现65株不同来源的弯曲菌,42株为空肠弯曲菌,23株为结肠弯曲菌。hipO、glyA基因PCR扩增结果与m-PCR扩增结果一致。16．9%菌株PCR鉴定结果与传统的生物化学鉴定结果不一致。100%（65/ 65）菌株cadF、flaA基因阳性,并且PCR扩增片段大小一致。virB的阳性率为10．8%（7/65）,其中空肠弯曲菌阳性率11．9%（5/42）,结肠弯曲菌阳性率为8．7%（2/23）。空肠弯曲菌、结肠弯曲菌cdtA的阳性率分别为100%（42/42）和78%（18/23）;空肠弯曲菌cdtB扩增的的阳性率为97．6%（41/42）。而23株结肠弯曲菌扩增结果均为阴性;空肠弯曲菌、结肠弯曲菌cdtC的阳性率皆为100%,但PCR扩增产物大小不一致,空肠弯曲菌为555 bp,结肠弯曲菌约为465 bp。结论m-PCR的方法可以有效的对空肠弯曲菌和结肠弯曲菌进行属内分型。中国菌株细胞溶涨毒素基因簇cdt基因的特征与文献报道国外菌株存在差异。     

空肠弯曲菌AhpC蛋白的克隆表达及抗原性分析

目的构建空肠弯曲菌烷基过氧化氢还原酶（ahpC）基因的原核表达系统,克隆表达AhpC蛋白,用Western blot以及ELISA方法检测表达蛋白的抗原性,为筛选空肠弯曲菌感染后特异性抗体检测试剂的制备奠定基础。方法用PCR方法从中国分离菌株ICDCCJ07001的染色体DNA中扩增出ahpC基因,将目的基因插入表达载体pGEX-4T-1后转化入大肠杆菌E.coliBL21（DE3）,IPTG诱导重组质粒pGEX-ahpC的表达。SDS-PAGE分析表达产物,采用GST标签亲和层析柱纯化表达蛋白。应用兔免疫血清、临床感染者血清以及健康无感染者血清,利用Western blot以及ELISA的方法分析AhpC蛋白的抗原性并初步评价其在ELISA检测方法中的应用。结果 PCR扩增及双酶切鉴定证实重组质粒构建成功。重组表达蛋白经飞行质谱鉴定为空肠弯曲菌AhpC蛋白,Western blot及ELISA检测结果显示AhpC具有特异抗原性。结论成功构建了ahpC重组表达载体pGEX-4T-1/ahpC,并在大肠杆菌中高效表达。空肠弯曲菌AhpC蛋白具有抗原性,可以作为空肠弯曲菌感染后血清抗体检测的特异抗原。     

一起空肠弯曲菌导致急性胃肠炎暴发事件的病原特征分析

目的 对一起急性胃肠炎暴发事件进行实验室检测分析。方法 对暴发事件中采集的病例粪便标本、厨师粪便标本、环境涂抹、食品原材料等样本进行实时荧光定量PCR检测和细菌分离培养分析。对分离菌株进行PFGE分型分析并对病例分离株进行抗生素敏感性检测和全基因组测序分析。结果 4例病例粪便标本空肠弯曲菌核酸检测阳性,其中1例未服用抗生素的病例分离到空肠弯曲菌;从4份生鸡样本中获得12个空肠弯曲菌单菌落和7个结肠弯曲菌单菌落。病例分离株对萘啶酸、环丙沙星、氯霉素、氟苯尼考和四环素耐药;基因组测序分析确定该菌株为ST10075型,并确定其染色体上含有cmeABCR、tetO/M和blaOXA-61等耐药元件,而23S rRNA的2 074和2 075位点均未发生突变,gyrA基因的257位点发生了C-T的突变。结论 实验室检测结果表明空肠弯曲菌的感染可能是导致此次急性胃肠炎暴发的主要病原。     

空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验方法团体标准解读

空肠弯曲菌和结肠弯曲菌是重要的食源性病原菌，是导致人类弯曲菌病的重要菌种。病原菌的培养、鉴定是食品污染以及人和动物感染诊断的“金标准”。中国CDC传染病预防控制所和国家食品安全风险评估中心等单位撰写了《空肠弯曲菌、结肠弯曲菌检验方法（T/CPMA 006－2019）》团体标准。标准以“科学性、规范性、适用性和可行性”为基本原则，提出从不同种类的标本、样品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的分离培养以及鉴定的方法，用于指导和规范我国不同种类的标本以及样本中两种弯曲菌的检测过程、检测步骤和鉴定方法，提高空肠弯曲菌、结肠弯曲菌的检测水平。     

EMA-qPCR检测空肠弯曲活菌方法研究

目的 建立一种快速定量检测食品中“活的”空肠弯曲菌的技术方案。方法 通过对10³ CFU/m~10⁶ CFU/mL的空肠弯曲菌进行叠氮溴化乙锭(EMA)的前处理研究,建立区分死菌与活菌的EMA前处理技术,与荧光定量PCR检测弯曲菌的方法相结合,建立EMA-qPCR组合检测技术,并进行模拟食品标本的验证。结果 空肠弯曲菌在10³ CFU/mL~10⁶ CFU/mL内,EMA的最优使用浓度为5 μg/mL,5 μg/mL的EMA-qPCR可区分出死/活空肠弯曲菌混合物中的死菌和活菌,并成功应用于模拟食品标本中“活的”空肠弯曲菌的检测。结论 EMA-qPCR可作为快速定量检测样本中“活的”空肠弯曲菌的方法。     

吉兰-巴雷综合征相关空肠弯曲菌脂寡糖基因簇序列分析

目的:分析吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome,GBS)相关空肠弯曲菌脂寡糖(lipo-oligosaccharides,LOS)基因簇序列特征。方法:利用PCR的方法分段扩增2株GBS相关空肠弯曲菌LOS的生物合成基因簇;对PCR扩增片段克隆测序并对其序列进行初步分析。结果:测序结果发现2株菌LOS基因簇序列为15895bp、12230bp,分别编码19个ORF、13个ORF。与已发表的LOS基因簇序列相比,其中一株为一新的GBS相关菌株LOS合成基因簇类别。结论:参与编码GBS相关空肠弯曲菌LOS生物合成基因簇结构复杂多样,本研究发现了又一种新的GBS相关菌株LOS类别。     

北京市零售鸡肉标本中弓形杆菌污染初步分析

目的 了解北京市零售鸡肉标本中弓形杆菌的污染情况。方法 随机购买北京地区6个农贸市场零售鸡肉样本60份，应用驱动增强双孔滤膜法对鸡肉样品进行弓形杆菌的分离培养，利用多重PCR及16S rRNA、rpoB基因测序的方法进行菌株及菌种鉴定。结果 60份零售鸡肉样本弓形杆菌的检出率为73.33%（44/60）。44份阳性标本中，共获得125株弓形杆菌分离株，其中以嗜低温弓形杆菌为主（91.20%），其次是布氏弓形杆菌（8.00%），斯氏弓形杆菌（0.80%）。两种及以上菌种混合污染率为15.00%（9/60）。结论 驱动增强双孔滤膜法可有效分离肉类样本中弓形杆菌。本地区零售鸡肉样本中弓形杆菌污染严重，鸡肉中嗜低温弓形杆菌的污染高于布氏弓形杆菌。     

一起产气荚膜梭菌食物中毒事件的实验室检测分析

目的应用3种方法对一起食物中毒事件中的可疑样品进行检测和结果分析。方法应用实时荧光PCR、数字PCR和平板计数培养法检测食物中毒事件中的可疑食品盐水猪肝,并对分离菌株用脉冲场凝胶电泳（PFGE）进行分型。 应用细菌生化试验、实时荧光PCR鉴定可疑食品中的产气荚膜梭菌;应用数字PCR对毒力基因进行绝对定量。结果可疑食品产气荚膜梭菌平板计数值为4 400 000 CFU/g,并分离到22个产气荚膜梭菌单菌落,实时荧光PCR检测可疑食品样本产气荚膜梭菌plc和cpe基因阳性,其中3个菌落plc+/cpe+,19个菌落plc+/cpe–;数字PCR检测可疑食品样本plc基因绝对定量值为1064 拷贝/μl;22个单菌落分为2种PFGE带型。结论通过3种方法检测可疑食品中产气荚膜梭菌,说明该起食物中毒可能由产气荚膜梭菌导致。