APA-BCC镇痛微囊在癌痛患者脑脊液中的生物学变化

了解海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞(APA-BCC微囊)植入癌痛患者脑脊液中的形态、活率及亮氨酸脑啡肽(L-EK)分泌的变化。将APA-BCC微囊按常规腰穿方法植入癌痛患者蛛网膜下腔。7或8天时采取脑脊液,观察APA-BCC的形态、细胞活率,用放射免疫法测定脑脊液中L—EK的含量。移植7天后,患者视觉模拟疼痛评分(VAS)均值由移植前的8．8降为2．4;脑脊液中APA—BCC微囊形态无明显变化;细胞活率由平均91．2％降为89．1％;L-EK含量较移植前增加了1．65倍。将APA-BCC微囊植入癌痛病人脑脊液中能够保持细胞存活、分泌亮啡肽,并产生镇痛效应。     

转染SV40永生化基因对正常成人肝细胞生长特性的影响

背景：生物型人工肝采用猪肝细胞或肝癌细胞作为移植物来源存在动物源性疾病和致瘤性的担心,而正常成人肝细胞也具有一定的局限性。 目的：通过检测转染前、后正常成人肝细胞的活率、生长曲线和细胞周期的变化,了解转染SV40永生化基因对正常成人肝细胞生长特性的影响。 方法：培养不同时间的正常人肝细胞和永生化正常成人肝细胞,采用胎盘蓝染色和AO-PI染色,于培养后1~8 d采用MTT染色法计数细胞活率;用MTT比色法测定细胞的A值并绘制生长曲线;采用流式细胞术检测细胞的生长周期。 结果与结论：3种染色法检测显示两种细胞的活率为95%~99%,存活率无明显差异。转染前、后的两种正常成人肝细胞的生长曲线无明显差异,均在培养 3~5 d时呈指数型生长,但转染后正常成人肝细胞较转染前增殖略快。采用流式细胞术测得的两种肝细胞的细胞周期：转染后肝细胞S期细胞占65.64%,G0~G1期细胞占34.36%,G2期细胞占0%;转染前肝细胞S期占21.27%,G0~G1期细胞占62.64%,G2期细胞占12.09%,提示转染后肝细胞的S期细胞明显增多,增殖能力增强。转染SV40永生化基因的正常成人肝细胞较转染前细胞的增殖活力增高,存活率无明显差异,提示转染后细胞增殖能力更强。     

分泌人肿瘤坏死因子α的基因工程细胞系的建立

目的：建立稳定的基因工程细胞系。方法：将含有人肿瘤坏死因子α（hTNFα）全长cDNA插入表达载体pSNAV2．0，产生重组质粒pSNAV2．0-TNFα，利用阳离子脂质体介导将其转染到人HEK-293细胞中，G418筛选阳性克隆hTNF／293，采用Western blot检测转染细胞上清中hTNF蛋白的表达。结果：通过Sal Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切、PCR及测序鉴定证明：在质粒pSNAV2．0中插入片段正确。采用RT—PCR和Western blot法检测表明HEK-293细胞培养上清中有hTNFα蛋白表达，分子量为17KDa。结论：成功构建重组质粒pSNAV2．0-TNFα，真核表达载体构建正确，转染HEK-293细胞后可有效分泌hTNFα蛋白，并能分泌到细胞外。     

培养微囊化牛肾上腺嗜铬细胞分泌镇痛物质能力的实验研究

目的：了解培养的海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊化牛肾上腺嗜铬细胞(BCCs)的儿茶酚胺(CA)和亮氨酸脑啡肽(L-EK)的分泌状态。方法：在非囊化BCCs与囊化BCCs(APA-BCCs)的孵育液中加或不加尼古丁，用高效液相色谱-电化学法检测孵育液中去甲肾上腺素和肾上腺素的含量、用放射免疫法检测孵育液中L-EK的含量。结果：培养1，3，5，7，9和11d时，在非刺激条件下，APA-BCCs与BCCs均能稳定地分泌CA和L-EK；尼古丁刺激时可显著增加BCCs和APA-BCCs分泌CA和L-EK的水平(P&;lt;0．05)；APA-BCCs与BCCs的基础及刺激分泌水平差异无显著性意义。结论：体外培养的BCCs及APA微囊化BCCs均具有儿茶酚胺类和脑啡肽类的基础及刺激分泌功能。     

帕金森病样大鼠牛嗜铬细胞脑内移植后的行为和组织学观察

目的 观察牛肾上腺嗜铬细胞异种移植于帕金森病（ＰＤ）样大鼠脑内的效果及移植物的存活情况。方法 将用酶消化和机械分离及纯化的牛肾上腺嗜铬细胞移植于ＰＤ样大鼠的脑纹状体内（损毁同侧）,以阿朴吗啡诱发的异常旋转行为为观察指标,比较细胞移植组、生理盐水组和非移植组间及移植前、后旋转行为的变化。结果 细胞移植组的ＰＤ样大鼠移植后的旋转行为较移植前明显改善（Ｐ〈０．０１）,而生理盐水组和非移植组的改善不明显;     

携带SV40T/HSV-tk基因永生化正常成人肝细胞的构建

目的构建永生化正常成人肝细胞为生物型人工肝提供安全有效的人肝细胞源。方法转染包装细胞,获得逆转录病毒;将该病毒感染正常成人肝细胞HL-7702;更昔洛韦毒性实验检测转染后肝细胞内HSV-tk基因;RT-PCR法检测转染后细胞内SV40T的mRNA;Western Blot法和免疫荧光染色检测转染后细胞内SV40T基因的蛋白表达。结果更昔洛韦检测转染后的肝细胞存活良好,而转染前的肝细胞死亡。RT-PCR法显示转染后的肝细胞内存在SV40T mRNA;Western Blot法和免疫荧光染色法显示转染后肝细胞内存在SV40T蛋白。结论转染后的正常成人肝细胞中含有SV40T和HSV-tk基因,并表达相关蛋白。     

Chiari畸形I型合并脊髓空洞患者的远红外热像特征分析

医用远红外热像是一门新兴的无辐射、非侵袭、低费用的功能影像学技术，它利用人体可向外界发射出红外热辐射信号的特征，经采集后，以伪色彩显示温度值，快速检测和定位皮肤温度增高或降低，进而分析相关疾病，对诊断和治疗提供客观的依据。本研究旨在探讨Chiari畸形I型（ChiarimalformationtypeI，CMI）合并脊髓空洞患者的远红外热像规律，分析其在该疾病的临床应用价值。     

长期体外培养条件下海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞的变化

目的:了解在体外长期培养的条件下,海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞的形态及其细胞活率的变化。方法:实验于2003-09/2004-05在解放军总医院老年医学研究所细胞生物学室完成。①材料:细胞为牛肾上腺嗜铬细胞;海藻酸钠和多聚赖氨酸由SIGMA公司提供;DMEM-H培养液由GIBCO公司提供;加强型小牛血清由HYCLONE公司提供。②方法:用海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微胶囊包裹牛肾上腺嗜铬细胞,以含有体积分数为0.1的小牛血清的DMEM-H培养基培养于CO2孵箱中,定期换液。③观察指标:在光学显微镜下观察微囊及囊内细胞的形态;以锥虫蓝染色法计数囊内细胞的数量和存活率,观察时间为8个月以上。结果:①微囊包裹后1d时,光镜下见微囊呈圆形,囊膜完整,表面光滑;囊内为单个细胞,均匀散在分布。体外培养35d时,微囊仍呈圆形,囊膜完整,表面光滑;囊内细胞聚集成体积较小的团块。体外培养240d时,微囊形态无明显变化;囊内大部分细胞已聚集成多个体积较大的团块,少数微囊内的细胞聚集成一个大的细胞团。②随着培养时间的延长,囊内细胞数量逐渐减少,从最初的(54±10)个/囊减少到培养243d时的(35±7)个/囊,但差异无显著性意义(P>0.05);囊内细胞的活率无明显改变,开始为95%,到培养243d时仍有93%的细胞存活。结论:在体外培养条件下,海藻酸钙-多聚赖氨酸-海藻酸钙微囊化牛肾上腺嗜铬细胞可较长时间地保持良好状态。     

偏侧帕金森病样大鼠脑内微囊化牛嗜铬细胞移植实验

目的:观察偏侧帕金森病样大鼠微囊化牛嗜铬细胞脑移植后多巴胺及其代谢产物含量的变化,探讨大鼠异常旋转行为改善的可能途径。方法:实验于1999-01／12在解放军总医院老年医学研究所完成。选择 6-羟基多巴立体定向损毁右侧黑质诱发的偏侧帕金森病样雌性SD大鼠30只,随机分为2组,微囊组20只,对照组10只。微囊组大鼠水合氯醛麻醉后于右侧纹状体立体定向植入约200个以海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠为材料含牛嗜铬细胞的微胶囊,对照组大鼠未做脑内移植手术。观察移植术前后阿朴吗啡(0．5 mg／kg)诱发的大鼠旋转行为。利用微透析技术采取帕金森病样大鼠脑纹状体区细胞外微透析液,用高效液相电化学层析法测定对照组大鼠在6-羟基多巴损毁右侧脑黑质后 16周时及两组大鼠在牛嗜铬细胞移植后12周时脑纹状体区细胞外液中单胺类物质含量的变化。结果:纳入偏侧帕金森病样大鼠30只,实验过程中微囊组麻醉意外、脑出血、肢体癫痫样抽搐死亡4只,对照组脑出血、不明原因死亡2 只。进入结果分析微囊组和对照维分别为16和8只大鼠。①微囊组移植后1周开始阿朴吗啡诱发的异常旋转次数明显减少,作用持续6个月以上(F=37．89,P<0．01)。②对照组帕金森病样大鼠右侧脑黑质损毁后16周时右侧脑纹状体区细胞外液中3,4-二羟基苯乙酸和高香草酸水平较左侧明显降低(t=7．012,4．394,P<0．01),右侧脑上述物质含量仅为左侧脑的8％和12％。③移植后12周,微囊组帕金森病样大鼠右侧脑纹状体区细胞外液中3,4-二羟基苯乙酸、高香草酸和5-羟基吲哚乙酸水平较对照组显著升高(t=4．273,4.402,6．445,P<0．01),分别提高了 3．1,5.3和2．7倍。结论:帕金森病样大鼠黑质损毁侧纹状体区多巴胺类物质含量明显降低, 移植微囊化牛嗜铬细胞后含量升高,使帕金森病样大鼠的运动功能障碍明显改善。     

大鼠胰岛的分离和纯化

目的：改进分离与纯化方法，以获得较高纯度和活力的大鼠胰岛。方法：用改良的酶法分离、Ｄｅｘｔｒａｎ梯度法纯化大鼠胰岛。用ＤＴＺ法判定胰岛纯度；用ＡＯ／ＰＩ法判定胰腺存活率；用大鼠胰岛移植于ＳＴＺ糖尿病小鼠法判定其功能。结果：雌、雄性ＳＤ和Ｗｉｓｔａｒ大鼠间胰岛形态无明显差异。Ⅴ型和Ⅺ型胶原酶对大鼠胰岛分离效果相似；分离以０．１％胶原酶分次消化、作用３０ｍｉｎ为宜，细胞存活率达９０％。纯化用２２％—１６％—１４％—９％梯度所获得胰岛的纯度＞９０％。胰岛移植于糖尿病小鼠可使其血糖从移植前的（２６．７０±２．５３）ｍｍｏｌ／Ｌ降低至（１３．９８±３．９２）ｍｍｏｌ／Ｌ，维持２～３ｄ。结论：所改进的制备方法可获得较高纯度和活力的大鼠胰岛。